НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 253-260
== МЕТОДЫ
УДК 612.8
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ НИТРОВАННЫХ ПО ТИРОЗИНУ БЕЛКОВ В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ: МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
© 2012 г. В. В. Фоминых12, *, М. В. Онуфриев1, И. Л. Каймовский3,4, Д. В. Гуз3,4, А. Б. Гехт3-5, М. Н. Захарова2, Н. В. Гуляева1
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва
2ФГБУ "Научный центр неврологии"РАМН, Москва 3Кафедра неврологии и нейрохирургии лечебного факультета ГБОУВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова", Москва Специализированная клиническая (психоневрологическая) больница № 8 им. З.П. Соловьёва, Москва
5Городская клиническая больница № 12, Москва
Нитрованные по тирозину белки принято считать маркерами нитрозативного стресса in vivo; в частности, при многих неврологических заболеваниях их уровень позволяет судить о его интенсивности. Разработана и подробно описана схема детекции нитрованных по тирозину белков методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с использованием двух коммерчески доступных антител к нитрованным белкам. В оптимальной постановке диапазон определяемых концентраций составляет 0.094—4 мкг/мл, нижний предел детекции 0.063 мкг/мл, IC50 = 0.538 мкг/мл. Приведены данные пилотных экспериментов по анализу нитрованных белков в цереброспинальной жидкости у пациентов в остром периоде инсульта и в ткани головного мозга после фокальной ишемии у крыс.
Ключевые слова: 3-нитротирозин, нитрованные белки, нитрозативный стресс, цереброспинальная жидкость, ИФА, метод.
ВВЕДЕНИЕ
Повышенная продукция оксида азота (NO) при нейродегенеративных заболеваниях и ишемии мозга сопровождается образованием реактивных форм NO, участвующих в модификации различных классов биомолекул, в том числе белков, ли-пидов и нуклеиновых кислот; подобный дисбаланс нитрергической системы рассматривают как нитрозативный стресс [1]. В результате взаимодействия NO с супероксид-анионом и СО2 образуются пероксинитрит и нитрозопероксикарбонат-ани-он, которые могут участвовать в реакции нитрования бензольного кольца в молекуле тирозина в ор-тоположении с образованием 3-нитро-Ь-тирозина (НТ) [2]. НТ и нитрованные по тирозину белки принято считать маркерами нитрозативного стресса in vivo. Данная модификация приводит к сдвигу pKa гидроксильной группы молекулы тирозина от 10.1 к 7.2, что изменяет структуру белков и, следовательно, их функции [3]. Считается, что нитрованные белки быстрее подвергаются деградации с образованием свободного НТ [4]. Кроме того, нитрование как патологическая посттрансляционная модификация запускает процесс образования
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а, тел.: +7 (495) 952-40-07, e-mail: fbminyhverik@gmail.com.
белковых агрегатов, вызывает формирование ауто-антигенов и продукцию аутоантител [5, 6].
В ряде работ показано усиление иммуногисто-химической окраски на НТ в срезах головного мозга экспериментальных животных, а также на аутопсийном материале, полученном от больных с рассеянным склерозом [7], боковым амиотрофи-ческим склерозом (БАС) [8], болезнью Паркинсо-на, болезнью Альцгеймера (БА) [9] и инсультом [10]. Накопление НТ в результате патологических процессов может происходить не только в головном мозге, но и в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), которая является важным объектом для выявления прогностических маркеров течения заболеваний нервной системы. В связи с этим при неврологических заболеваниях предпринимались попытки измерения НТ различными методами в ЦСЖ. В табл. 1 приведены результаты работ, в которых детектировали уровень общего НТ, свободного НТ и связанного с белком НТ в образцах ЦСЖ при ряде патологий нервной системы. Как видно из представленных данных, анализ НТ в ЦСЖ различными методами в ряде случаев дает противоречивые результаты при одном и том же неврологическом заболевании (например, при БА), что свидетельствует о необходимости оптимизировать существующие методы детекции НТ в ЦСЖ.
Результаты определения различных форм НТ в ЦСЖ больных и контрольных группах людей
Заболевание Метод Общий НТ Свободный НТ Нитрованные белки Источник
Норма ИХ-2МС 335-5730 пг/мл - - [17]
БА (п = 17) ГЖХ-2МС - 0.44 ± 0.031 нМ - [18]
БАС (п = 14) 0.38 ± 0.034 нМ
Норма (п = 19) 0.35 ± 0.019 нМ
БА ИФА <2 нМ - - [21]
БА (п = 32) ЖХ-2МС - 1.03 ± 0.46 нМ 0.0142 ± 0.0094 ммоль/моль [16]
Норма (п = 32) 0.40 ± 0.28 нМ 0.009 ± 0.005 ммоль/моль
БА ВЭЖХ-ЭД - Повышен - [13]
БАС ВЭЖХ-ЭД - Повышен - [14]
Инсульт ВЭЖХ-ЭД - 10.2 ± 3.3 нМ - [11]
Норма 1.4 нМ
БП (п = 18) ВЭЖХ-ЭД - 1.6 ± 0.7 нМ - [12]
Норма (п = 20) 1.5 ± 0.5 нМ
Энцефалопатия новорожденных ВЭЖХ-ЭД - 0.45 ± 0.33 мкМ - [15]
Норма 0.25 ± 0.13 мкМ
Рассеянный склероз ИФА [23] 20 нг/мл - - [22]
Норма 2 нг/мл
ЧМТ (п = 7) - 22.4-97.6 мМ - - [48]
Норма - - -
Для определения свободного и связанного с белком НТ в ЦСЖ используется ряд хроматогра-фических методов: высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимическим типом детекции (ВЭЖХ-ЭД) [11—15], жидкостная хроматография, сопряженная с тандемной масс-спек-трометрией (ЖХ-2МС) [16, 17], хроматография в газовой фазе (ГЖХ-2МС) [18]. Эти методы исследования связаны с многоступенчатой пробоподго-товкой и неприменимы для исследования большого числа образцов в условиях клиники. Более того, большинство результатов по определению НТ в ликворе было получено при помощи ВЭЖХ-ЭД, метода, подвергавшегося критике из-за детекции артефактных пиков [19], а также из-за использования хлорной кислоты на стадии пробоподготовки. В ряде работ показано, что снижение рН раствора в присутствии нитратов и нитритов приводит к образованию дополнительного НТ из тирозина [20], что может объяснить неоправданно высокий уровень НТ, полученный в работах с использованием данного метода (табл. 1). При использовании коммерческого набора для иммуноферментного анализа (ИФА, НуеиН Ь^есИпо1о§у, Голландия) со-
держания общего НТ в ЦСЖ, его уровень в большинстве проб был ниже предела обнаружения [21]. Zaba1eta и соавт. [22] применили сэндвич-ИФА для обнаружения общего уровня НТ в ЦСЖ, но не указали источник и свойства "антител к модифицированным аминокислотам", сославшись на работу [23], тогда как при использовании антител к НТ и нитрованным белкам в сэндвич-методе можно определить только НТ, связанный с белком. Разработаны коммерческие наборы для определения НТ (общего, свободного и связанного с белками) в крови, но чувствительность данных наборов недостаточна для определения НТ в ЦСЖ. Для определения уровня НТ в ткани головного мозга также используются различные хроматографические методы [24] и ИФА [25, 26], но результаты оценки уровня НТ противоречивы.
В связи с разбросом данных по уровню НТ (свободного, связанного с белками и общего) ключевое значение имеет метод определения. В работе [27] сравнивали четыре коммерческих ИФА-набо-ра для определения НТ в крови, в результате чего были получены противоречивые результаты по уровню абсолютных значений и при сравнении
между группами. Таким образом, использование коммерческих наборов не гарантирует точность и воспроизводимость результатов [28].
Цель данной работы — создание оптимальной схемы непрямого конкурентного ИФА для определения нитрованных по тирозину белков в ЦСЖ и супернатантах мозга с использованием коммерчески доступных антител.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В работе использовали бычий сывороточный альбумин (БСА, MP biomedicals, США), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА, Reanal, Венгрия), твин 20, 3-нитро-Ь-тиро-зин (Fluka, США), тетранитрометан и O-ортофе-нилендиамина дигидрохлорид (Sigma Aldrich, США), моноклональные антитела к нитротиро-зин-БСА (моноАТ Cayman Chemical Company, США, НТ-БСА), поликлональные антитела к нитрованным KLH (полиАТ, Millipore, США), антитела козы, конъюгированные с пероксидазой, специфичные к иммуноглобулинам мыши (Jackson ImmunoResearch, США), кролика (BioRad, США), 96-луночные планшеты (Nunc, Германия), колонки BioSpin (BioRad, США) и Microcon UltraCel Ym10 (Millipore, США). Измерения проводились на мультифокальном плашечном ридере (Perkin-Elmer).
Забор и подготовка биологического материала. Сыворотка крови и ликвор были взяты у больных с острым инсультом, поступившим в неврологическое отделение 12 ГКБ. Забор крови осуществляли из локтевой вены натощак в пробирки с активатором свертывания (Vacutainer, США). Сыворотку получали центрифугированием крови в течение 20 мин при 1500 g при 4°C. Полученную над осадочную жидкость переносили в отдельные пробирки и замораживали при температуре —70°C. Люмбальная пункция всем больным была произведена после получения информированного согласия. Пробы ЦСЖ были собраны в стерильные пробирки, центрифугированы в течение 10 мин при 1500 g при 4°C, затем аликвотированы и заморожены при температуре —70°C. Контрольные образцы ликвора были получены от больных с острой хирургической патологией до введения препарата для субдуральной анестезии.
В работе использовали крыс-самцов линии Ви-стар (питомник Столбовая, Московская область), которые содержались в условиях свободного доступа к воде и пище при 12-часовом периоде освещения. Для моделирования фокальной ишемии мозга крысам была проведена 20-минутная окклюзия средней мозговой артерии (ОСМА), по методике, описанной ранее [29]. Крыс декапитиро-вали через 24 ч после ОСМА, извлекали мозг, охлаждали в изотоническом растворе Nad, затем
выделяли кору больших полушарий. Материал сразу замораживали в жидком азоте и в дальнейшем хранили при —80°С. Ткань гомогенизировали в пяти объемах PBS (фосфатно-солевой буфер, pH 7.4) содержащего по 5 мкг/мл ингибиторов протеаз, пепстатина А и апротинина, а также 1 мМ фенилметилсульфонилфторида. Полученный го-могенат центрифугировали в течение 30 мин при 15000 g. Аликвоты супернатанта использовали для определения уровня нитрованных по тирозину белков.
Методы. Непрямой конкурентный твердофазный ИФА для определения содержания нитрованных по тирозину бел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.