НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 1, с. 28-34
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.112.4:616.89-008.441.13-099-085.272
МАЛАТ-АСПАРТАТНЫЙ ШУНТ В РЕАКЦИЯХ АДАПТАЦИИ НЕЙРОНОВ К УСЛОВИЯМ ИШЕМИИ: МОЛЕКУЛЯРНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ
© 2012 г. И. Ф. Беленичев, Ю. М. Колесник, С. В. Павлов, Е. П. Соколик*, Н. В. Бухтиярова
Запорожский государственный медицинский университет
Острая или хроническая ишемия мозговой ткани обуславливает целый каскад патобиохимических реакций, которые в конечном итоге приводят к развитию очагового неврологического дефицита, дис-циркуляторной энцефалопатии или к гибели больного. В различные сроки ишемии (1 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 120 ч и 21 сут) установлено, что в период наибольших ишемических нарушений (24—72 ч) наблюдается гиперпродукция лактата на фоне угнетения гексокиназы (ГК) — фермента, катализирующего первую "пусковую" реакцию гликолиза. Рост малата с повышением активности митохондриальной (мМДГ) и цитозольной (цМДГ) малатдегидрогеназ в первые часы церебральной ишемии свидетельствует об активации малат-аспартатного челночного механизма транспорта восстановленных эквивалентов в митохондрии. Угнетение продукции малата и активности НАД-зависимой малатдегидроге-назы (НАД-МДГ-мх) коррелирует с падением АТФ, ЖР-70 и фактора, индуцируемого гипоксией (Н!Р-1а), а также со степенью неврологических нарушений. Можно предположить, что в ответ на формирование ишемии головного мозга экспрессируется Н!Р-1а, который инициирует запуск компенсаторных механизмов выработки энергии. В дальнейшем регуляция этих процессов переключается на ЖР-70, который "пролонгирует" действие Н!Р-1а, а также самостоятельно поддерживает экспрессию активности НАД-МДГ-мх, тем самым длительно поддерживая активность малат-аспартат-ного челночного механизма.
Ключевые слова: ишемия головного мозга, компенсаторные шунты продукции энергии, митохондриаль-но-цитозольный транспорт энергии, белки теплового шока.
Сосудистые заболевания головного мозга — одна из ведущих причин смертности и инвалидиза-ции населения всего мира. Окклюзия сосудов, питающих головной мозг, является начальным звеном в цепочке неблагоприятных изменений, которые приводят к грубым нарушениям метаболизма нейронов, структурно-функциональным изменениям, нередко заканчивающимся гибелью нервных клеток. Острая или хроническая ишемия мозговой ткани обуславливает целый каскад патобиохими-ческих реакций, которые в конечном итоге приводят к развитию очагового неврологического дефицита, дисциркуляторной энцефалопатии или к гибели больного [1, 2]. Тесная взаимосвязь нарушений энергетического и пластического обмена и их влияние на течение и прогноз заболевания нередко не учитываются при разработке схем лечения, а основой патогенетической терапии считается восстановление гемодинамики. В последнее время нарушениям энергетического метаболизма и воз-
* Адресат для корреспонденции: Украина, Запорожье, пр. Маяковского, 26, 69035, раб. тел: (0612) 24-64-69, моб. тел: +380970594381; факс: (0612) 33-60-07, e-mail: sokolikep@gmail.com.
можностям его коррекции уделяется большое внимание [3, 4]. Многие ученые считают, что метаболическая терапия, осуществляемая как в острый период инсульта, так и в восстановительный, является мощным превентивным фактором по отношению к повторным инсультам, инвалидизации больных и их гибели [5, 6].
Фундаментальными исследованиями процессов энергопродукции в условиях ишемии установлено, что получение энергии осуществляется путем анаэробного гликолиза, реакции которого завершаются образованием только 2 молекул АТФ и накоплением лактата [7, 8]. На начальном этапе церебральной ишемии любой этиологии в митохондриях снижается скорость аэробного окисления. Это ведет к уменьшению количества АТФ и возрастанию содержания АДФ и АМФ и, как следствие, к снижению коэффициента [АТФ]/([АДФ] + [АМФ]). При низком соотношении [АТФ]/([АДФ] + [АМФ]) активируется гексо-киназа (ГК), что позволяет резко увеличить пропускную способность реакций анаэробного гликолиза. Клетка в этих условиях расходует гликоген, обеспечивая себя энергией за счет бескислородно-
го распада глюкозы [9, 10]. На этом этапе еще может идти адаптация к гипоксии и стабилизация энергообмена. Однако такая стабилизация обычно бывает недолгой и сопровождается достаточно быстрым истощением запасов гликогена, и анаэробный гликолиз не способен длительное время и в полном объеме обеспечивать энергетические нужды головного мозга. Конечный продукт гликолиза — лактат, нарастание которого провоцирует внутриклеточный ацидоз. На ранних этапах ишемии клеточный ацидоз можно рассматривать в качестве защитной реакции, так как снижение рН оказывает стабилизирующее действие на клеточные мембраны. Однако прогрессирование ацидоза вызывает денатурацию некоторых белков и формирование в цитоплазме зерен, что проявляется в появлении помутнения цитоплазмы ("мутное набухание", "зернистая дистрофия") [11]. Усиленное освобождение лактата при гипоксии дает метаболический лактатацидоз, который блокирует активность генов, что лимитирует адаптацию. На этой стадии гипоксии в клетке формируется истинный дефицит АТФ, поскольку аэробный механизм не реализуется из-за кислородного дефицита, а анаэробный — из-за ацидоза [7, 9, 12]. В связи с этим устойчивость к гипоксии формируется за счет перестройки энергетических путей, предполагающей мобилизацию механизмов поставки протонов для окислительного фосфорилирования и экономного использования недостающего кислорода. Считается, что основным из таких путей является сукцинатоксидазный, и многие компенсаторные механизмы направлены на анаэробный синтез сукцината (трансаминазный цикл М.И. Кондра-шовой, цикл Робертса и др.). Поэтому на рубеже 80-90-х годов прошлого столетия метаболической терапии придавали важное значение в качестве превентивного фактора по отношению к повторным инсультам, инвалидизации больных и их гибели как в острый период инсульта, так и в восстановительный [13].
Однако клиническое применение препаратов янтарной кислоты (реамбирин, янтавит, поли-сар, цитофлавин и др.) показало их низкую терапевтическую эффективность в условиях острой церебральной ишемии. В последнее время благодаря революционным открытиям в области молекулярной биологии был приподнят занавес таинственности, скрывающий значение регулятор-ных белков в функционировании многих звеньев энергетического метаболизма. Так, в последнее время рядом экспериментальных работ установлена активация в условиях ишемии генов, кодирующих синтез фактора, индуцируемого гипоксией (НШ-1) и особенно его субъединицы НШ-1Ъ (120 кДа). НШ-1Ъ в условиях ишемии отвечает за экспрессию гена эритропоэтина и еще приблизи-
тельно 60 генов, продукты которых участвуют в таких процессах, как пролиферация, апоптоз, ангио-генез, стабилизации белковых молекул в условиях оксидативного стресса. Кроме того, в последнее время появились данные о роли белков теплового шока (Н8Р) в стабилизации НШ-1Ъ при церебральной ишемии, сопровождающейся интенсификацией процессов свободнорадикального окисления, смещением тиол-дисульфидного равновесия, развитием нитрозирующего стресса, глу-таматной эксайтотоксичности [14—16]. Н8Р индуцируются в клетках всех живых организмов в ответ на действие многочисленных стрессовых факторов, таких, как тепловой шок, гипоксия, ишемия, метаболические нарушения, вирусная инфекция и воздействия фармакологических агентов. Гены этих белков активируются не только в условиях стресса, но и в ходе основных процессов клеточной жизнедеятельности, пролиферации, диффе-ренцировки и апоптоза [17, 18].
Учитывая, что представления о доминирующей роли сукцинатоксидазного механизма сформулированы на обобщении результатов опытов с изолированными органами, культурами тканей при ишемии и гипоксии разной степени выраженности, представилось целесообразным изучить состояние лимитирующих звеньев энергетического обмена и компенсаторных метаболических шунтов и механизмов их молекулярной регуляции при ишемии головного мозга. При этом одновременное исследование различных метаболических процессов и уровня белков теплового шока (Н8Р-70) и субъединицы НШ-1а дает информацию о направленности и степени изменений этих процессов. Учитывая вышеизложенное, цель настоящего исследования — исследование показателей, характеризующих состояние транспортных систем поставки восстановительных эквивалентов и субстратов окисления в митохондрии, цикла Кребса, тканевого дыхания, а также изучение фондов мак-роэргических фосфатов (АТФ), активности ферментов, регулирующих митохондриально-цито-зольный транспорт энергии, содержания Н8Р-70 и НШ-1а в митохондриях головного мозга монгольских песчанок с моделированием острой церебральной ишемией (ОЦИ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нарушение мозгового кровообращения моделировали путем необратимой односторонней перевязки сонной артерии у монгольских песчанок (Мепопе8 ишсиМиз) массой 65—70 г, которые по данным литературы последних лет наиболее часто используются для моделирования нарушения мозгового кровообращения, что обусловлено разъединением большого круга кровообращения и слабо
развитой системой коллатерального кровообращения [19].
Все экспериментальные процедуры проводили согласно требованиям, взятым из "Положения про использование животных в биомедицинских исследованиях". Животных выводили из эксперимента под тиопентал-натриевым наркозом (40 мг/кг) внутрибрюшинно.
Биохимические исследования головного мозга поводили через 1 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 120 ч и 21 сут ишемии. Для этого обогащенную фракцию нейронов путем дифференцированного ультрацентрифугирования разделяли на две фракции — цито-зольную и митохондриальную. Центрифугирование проводили при 60000 g в рефрижераторной центрифуге Centrifuge 5804R (Eppendorf, Germany). В полученных цитозольной и митохондриаль-ных фракциях спектрофотометрически исследовали следующие показатели: уровень активности митохондриальной и цитозольной НАД- и НАДФ-зависимых малатдегидрогеназ (мМДГ и цМДГ); сукцинатдегидрогеназы (СДГ), митохондриальной аспартатаминотрансферазы (АсТ), цитохро-моксидазы (Ц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.