ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ, 2013, том 115, № 2, с. 242-247
= БИОФОТОНИКА :
УДК 577.352:576.314:591.826
ОПТИЧЕСКАЯ РЕГИСТРАЦИЯ ПОР В МЕМБРАНЕ ЖИРОВОЙ КЛЕТКИ © 2013 г. И. Ю. Янина*, **, В. А. Дубровский*, В. В. Тучин**, ***, ****
* Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, 410026Саратов, Россия ** Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, 410012 Саратов, Россия *** Институт проблем точной механики и управления РАН, 410028Саратов, Россия **** Университет Оулу, Финляндия E-mail: irina-yanina@list.ru Поступила в редакцию 24.05.2012 г.
Методом оптической цифровой микроскопии на мембранах жировых клеток экспериментально зарегистрированы "образования", которые могут трактоваться как капельки цитоплазмы, вытекающей через поры в мембране. Исследуется влияние водно-спиртового раствора бриллиантового зеленого на количество "образований" и их размеры. Показано, что оптическое действие на сенсибилизированные бриллиантовым зеленым жировые клетки приводит к увеличению количества "образований" (пор) после окончания облучения. Результаты экспериментов подтверждают предложенный ранее авторами механизм фотохимического действия на сенсибилизированные клетки жировой ткани — дополнительное образование пор в мембране сенсибилизированной клетки в ответ на селективное фотовоздействие. Предложенный подход к регистрации микропор в мембране жировой ткани путем регистрации капельки цитоплазмы, вытекающей из клетки, можно рассматривать как способ оптической регистрации пор нанометрового диапазона.
DOI: 10.7868/S0030403413080217
ВВЕДЕНИЕ
Бимолекулярный слой фосфолипидов составляет основу любой клеточной мембраны. В процессе жизнедеятельности непрерывность бислоя может нарушаться с образованием структурных дефектов. Естественно, что при этом происходит изменение проницаемости и стабильности мембраны. В зависимости от воздействия (осмотический шок [1], действие спирта [2—5] или лазерный фотомеханический стресс [6—11]), поры могут быть разного размера — от долей нанометра [1—5] до 100 нм [8]. Размеры таких пор достаточны для выхода различных веществ, содержащихся в цитоплазме клеток. Выход веществ сопровождается в свою очередь снижением разности осмотического давления, при этом натяжение мембраны уменьшается, а поры затягиваются [1].
В работе [12] исследовалось фотодинамическое воздействие бриллиантового зеленого (БЗ) на жировые клетки in vitro. Результатом был липо-лиз клеток. В работах [12—15] была выдвинута гипотеза о том, что при липолизе в мембране клетки образуются поры, через которые часть содержимого клетки (например, жирные кислоты, триг-лицериды) выходит в межклеточное пространство. Вероятность выхода триглицеридов через поры мембраны клетки, находящейся в естественном состоянии, весьма мала, учитывая соотношение размеров пор (0.1—100 нм) с размерами капель липидов (0.2—5 мкм) [16]. Однако в ре-
зультате гидролиза триглицериды распадаются на свободные жирные кислоты (0.8—2 нм), а последние под действием липазы на глицерин и воду [16—18]. Продукты гидролиза могут свободно выходить из клетки через поры, так как их размеры малы по отношению к размерам пор. При этом показатель преломления межклеточной жидкости (пмж = 1.36) [19] приближается к показателю преломления внутриклеточной жидкости жировой клетки (пвк = 1.44), среда становится оптически более однородной и как результат более прозрачной [20]. Выдвинутая гипотеза хорошо согласуется с экспериментальными результатами [12—15], однако для подтверждения этой гипотезы предпочтительно непосредственное наблюдение образования пор в мембранах.
Оптическая регистрация столь малых пор невозможна, так как их размеры много меньше длины волны видимого света. Электронная микроскопия позволяет исследовать объекты с размерами в нано-метровом диапазоне, однако используемая для этого технология пробоподготовки (обезвоживание образца) оказывается неприемлемой для решения задачи настоящего исследования, поскольку обезвоживание образца жировой ткани делает принципиально невозможным анализ фотохимического действия на клетку в режиме реального времени.
В связи с этим целью настоящего исследования является поиск подходов к оптической реги-
страции нанопор в мембранах клеток и на ее основе анализу фотохимического действия на клетки жировой ткани человека in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлась подкожная жировая ткань, извлеченная при пластической операции мужчин и женщин 40—60 лет. После замораживания (при температуре —28°С в течение суток) приготовленные с помощью микротомного ножа срезы тканей толщиной 100—150 мкм окрашивались с одной стороны (облучаемой поверхности ткани) в течение 10 мин, а затем помещались между двумя покровными стеклами. В качестве красителей использовались водный или 40%-водно-спиртовой растворы БЗ. Кроме того, для сравнения исследовалось воздействие на жировые клетки водно-спиртовых растворов с различной концентрацией спирта (0, 40, 50, 60, 70, 80, 90%), а также исследовались клетки ткани в их естественном состоянии без какого-либо воздействия на них. Заметим, что независимо от типа растворителя и его свойств содержание БЗ составляло 6 мг/мл. Исследованию подвергались 24 образца жировой ткани от одного донора по 3 образца для каждого из 4 типов экспериментов: изучение влияния водного и водно-спиртового растворов БЗ на жировую ткань, анализ влияния водно-спиртового раствора на тот же биообъект, а также "контроль" — жировая ткань без какого-либо химического воздействия — 12 образцов. В то же время все вышеупомянутые эксперименты проводились в двух режимах — с облучением биообъекта и без него, что суммарно соответствует 24 анализируемым срезам жировой ткани.
Каждый приготовленный образец размещался на термостатируемом столике цифрового микроскопа БИОЛАМ П2-1 (увеличение объектива 90х, поле зрения — около 50 мкм, пространственное разрешение 25 пкс/мкм). Термостати-рование обеспечивалось жидкостным термостатом ТЖ-ТС-01, с помощью которого поддерживалась фиксированная комнатная температура образца 25°C.
К окуляру микроскопа присоединялась камера DCM500 с ПЗС-матрицей (максимальное разрешение 5 Мп, скорость съемки 2 кадра/с, динамический диапазон 75 дБ), подключенная к персональному компьютеру. Диодная лампа (Ultra Lume Led 5) размещалась на расстоянии 2 мм от образца, что обеспечивало плотность мощности ~75.5 мВт/см2, которая определялась с помощью калиброванного фотоприемника Newport Power Meter 1815-c. Эффективность фотохимического действия обеспечивалась совпадением спектра излучения лампы (максимумы излучения на 442 и 597 нм) со спектром поглощения БЗ (максимумы поглощения на 440 и 650 нм) [12—14]. Диаметр
Рис. 1. Изображение жировой клетки: 1, 2, 3 — "образования", 4 — мембрана клетки, 5 — септа.
светового пятна на биообъекте составлял 2 мм. Длительность облучения варьировалась от 3 до 15 мин.
После облучения образцов их изображения регистрировались в виде серий кадров через равные промежутки времени с периодом около 5 мин и сохранялись в памяти ПК. Программное обеспечение для поддержки работы камеры включает программу Aver Media EZ Capture. Запись файлов изображений на диск осуществляется в формате BMP (Windows Bitmap).
Каждое цифровое изображение выбранной клетки образца биоткани, полученное при регистрации изображения "на просвет", рассматривалась как статистическая выборка значений фотоотклика по пикселям. С оптической точки зрения каждый элемент выборки, соответствующий данному пикселю, может рассматриваться как числовое значение коэффициента пропускания образца биоткани в данной точке пространства, а анализируемые изображения определенных зон этого образца как распределение коэффициента пропускания. Техника определения коэффициента пропускания биоткани T подробно описана в работе [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изображение жировой ткани представлено на рис. 1. Размер клетки, видимой в поле зрения микроскопа, около 50 мкм. На ее мембране наблюдаются "образования", три из которых выделены прямоугольниками и пронумерованы.
Подобные "образования" наблюдались и на других клетках ткани. Последовательное получение изображений клетки с периодом в 5 мин показало, что эти "образования" со временем изменяли свои размеры и форму, что отражено на рис. 2а. Здесь приведено изображение одного и
(а)
* Ц 1 1 1
1 2 3 4Х
2 4 6 8
X, мкм
Рис. 2. (а) Изображения "образований" в зависимости от времени наблюдения: 25 (1); 81 (2), 117 (5), 159 мин (4); (б) — зависимость коэффициента пропускания Т от координаты Х для различного времени наблюдения: ■ - 25, О - 81, • - 117, □ - 159 мин.
N шт 150
100
50
\
40
120 200 Время наблюдения, мин
Рис. 3. Зависимость количества "образований" N от времени наблюдения для необлученных образцов: 1 -неокрашенный образец (контроль), 2 - образец жировой ткани при воздействии 40%-водно-спиртового раствора, 5 - образец жировой ткани, окрашенный водным раствором БЗ, 4 - образец жировой ткани, окрашенный 40%-водно-спиртовым раствором БЗ.
0
того же "образования" в различные моменты времени наблюдения, начиная от момента выключения источника светового действия на образец до момента получения п-го изображения.
Компьютерная обработка цифрового изображения, представленного на рис. 2а, позволяет получить зависимость коэффициента пропускания ткани Т от координаты вдоль горизонтальной линии, проходящей через центры наблюдаемых "образований" X (рис. 2б). На рис. 2б можно видеть не только распределение Т(Х) в пространстве, но и его временную динамику Т(/). Следует отметить, что учитывая соизмеримость толщины среза ткани (100-150 мкм) с размерами жировой клетки (30-50 мкм), а также методику нанесения БЗ в случае исследования сенсибилизированной ткани (слой БЗ наносился на одну, облучаемую сторону образца), измеренный коэффициент пропускания ткани во многих случаях характеризовал изменения, связанные именно с вариациями коэффициента пропускания исследуемой клетки. В пользу последнего свидетельствуют результаты [13] - оценки показывают, что соотношение коэффициентов пропускания Т1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.