ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ, 2013, том 115, № 2, с. 248-254
-- БИОФОТОНИКА
УДК 57.086.2
ОПТИЧЕСКАЯ ЦИФРОВАЯ МИКРОСКОПИЯ ДЛЯ ЦИТО-И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ IN VITRO
© 2013 г. Ю. А. Ганилова*, А. А. Долмашкин*, В. А. Дубровский*, И. Ю. Янина*' **, В. В. Тучин**' ***' **** * Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, 410012 Саратов, Россия ** Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, 410012 Саратов, Россия *** Институт проблем точной механики и управления РАН, 410028Саратов, Россия **** Университет Оулу, Финляндия E-mail: Ganilova@yandex.ru Поступила в редакцию 24.05.2012 г.
Экспериментально исследованы зависимости пространственного разрешения и поля зрения оптического микроскопа, снабженного ПЗС-камерой, от коэффициента увеличения объектива. Измерение этих характеристик показало, что вполне достижимо пространственное разрешение в 20— 25 пкс/мкм при поле зрения порядка 110 мкм, что приемлемо для детального изучении процессов в клетке. Предложено расширение динамического диапазона цифровой камеры путем измерения и аппроксимации ее световой характеристики с последующим построением соответствующей калибровочной кривой. В качестве биологических объектов использованы клетки жировой ткани человека, а также эритроциты и их иммунные комплексы крови человека — оба объекта исследовались in vitro. Опыт использования оптической цифровой микроскопии для решения конкретных задач цитологии и гематологии может оказаться полезным как в биомедицинских исследованиях, так и в экспериментах с объектами небиологического происхождения.
DOI: 10.7868/S0030403413080096
ВВЕДЕНИЕ
Цифровая оптическая микроскопия, сопровождаемая математической обработкой фотоизображений, нашла широкое применение в биомедицинских исследованиях и медицинской практике. Основные принципы цифровой микроскопии и их использование в биомедицине изложены, например, в [1—4]. Цифровая фото- и микрофотография нашли применение в таких областях медицины, как хирургия [5], онкология [6], офтальмология [7], пролетная и слайдовая цитометрия [8] и др. [9]. Микробиологические исследования также активно используют этот метод изучения биообъектов [10].
Наибольший интерес авторов привлекает применение цифровой микроскопии в области цитологии [11—16] и гематологии [17—23]. Идентификация клеток, измерение их размеров рассмотрено в [14—16]. В области гематологии в [17] визуализируются эритроциты, регистрируются колебания мембраны эритроцита во времени с нанометровой чувствительностью, что позволяет изучать механические и динамические свойства мембраны эритроцитов. Движение биологических клеток рассмотрено в [15, 16], а клеток крови in vivo в [16, 20, 24]. Новый способ автоматической регистрации лейкоцитов на основе цифровой микроскопии описан в [18]. Взаимодействие
форменных элементов крови с искусственными материалами исследуется в [19] методом электронной микрофотографии не оптически, однако представляется весьма интересным подход к компьютерной обработке видеоизображений. Потоки форменных элементов крови in vivo анализируются в [21].
К собственным экспериментальным работам авторов в области цито и гематологии с использованием принципов цифровой микроскопии относятся [25—32]. В работах [25—27] количественно оценивается обнаруженный методом цифровой микрофотографии эффект фотодинамического действия на клетки жировой ткани in vitro. Такой анализ в рамках оптического метода исследования позволил выявить механизм действия света на сенсибилизированные клетки жировой ткани. В отличие от [25—27], где биологический объект оставался неподвижным, а его оптические свойства изменялись во времени, в [28—32] метод цифровой фотографии использовался для исследования обратного случая — регистрируемый биообъект перемещался в пространстве, но практически не изменял свою структуру и свойства. Действительно, в [30—32] метод цифровой микрофотографии применен для регистрации потоков эритроцитов или их иммунных комплексов (агглютинатов) in vitro. В [28, 29] принципы цифровой фотогра-
и 50 мкм
200 мкм 50 мкм
200 мкм
Рис. 1. Фрагмент камеры Горяева при увеличении объектива микроскопа 10х.
фии применены для регистрации процесса седиментации (оседания) эритроцитов и их агглюти-натов. Явление агглютинации (склеивания) эритроцитов специфической сывороткой лежит в основе определения групповой принадлежности крови человека. Отметим, что цифровая микрофотография с использованием принципа распознавания образов применена в приборе для определения группы крови PK7200 Automated Micro Plate System (Olympus Diagnostics) [22, 23].
Опыт экспериментальных исследований биологических объектов с использованием метода цифровой фотографии [25—32] показывает, что наиболее важными этапами являются подбор оптических характеристик цифрового микроскопа и учет нелинейности световой характеристики ПЗС-камеры. Анализ этих компонентов цифровой микроскопии применительно к задачам цито-и гематологии является целью настоящей работы.
ОПТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИФРОВОГО МИКРОСКОПА
Пространственное разрешение (масштаб) цифрового микроскопа
Исследования фотодинамического действия на сенсибилизированную жировую ткань [25—27] проводились с использованием микроскопа БИОЛАМ П2-1 с полихромной ПЗС-камерой типа DCM500 с размером матрицы 5 Мпкс. Регистрация эритроцитов и их агглютинатов проточным методом [28—32] велась с применением оптического микроскопа ЛОМО БИОМЕД и полихромной цифровой камеры Logitect-Quick Cam (2 Мпкс). В дальнейшем оптический микроскоп, снабженный ПЗС-камерой, будем называть оптическим "цифровым микроскопом". Несмотря на
Пространственное разрешение, пкс/мкм
20
10 -
20
40
60
80
Увеличение
Рис. 2. Пространственное разрешение цифрового микроскопа (пкс/мкм) как функция увеличения его объектива.
различие в экспериментальном оборудовании, некоторые вопросы в [25—32] являются общими, например, возможные значения пространственного разрешения (масштаба) применяемых цифровых микроскопов. Под термином "пространственное разрешение" будем понимать количество пикселей на единицу длины наблюдаемого объекта (пкс/мкм). Представляется важным подчеркнуть, что нами анализируется разрешение не ПЗС-матрицы используемой камеры, а цифрового микроскопа, т.е. разрешение с учетом оптической части прибора.
Измерение зависимости пространственного разрешения цифрового микроскопа от увеличения объектива проводилось с использованием камеры Горяева — устройства, широко применяемого в медицине для счета форменных элементов крови и других клеток. Фрагмент камеры Горяева, полученный с помощью цифрового микроскопа, представлен на рис. 1. Устройство представляет собой стеклянную пластину определенного профиля с нанесенными на нее штрихами, расстояния между которыми указаны на рис. 1. Камера Горяева использовалась как мерная линейка, с помощью которой определялось пространственное разрешение цифрового микроскопа в зависимости от увеличения объектива К.
Результаты измерений представлены на рис. 2. Из рис. 2 видно, что объективы с увеличением 20х и 40х вполне приемлемы для регистрации эритроцитов [28—32], средние размеры которых составляют 8 мкм (следовательно, около 40 или 80 пкс соответственно), или для визуализации жировых клеток с размерами 30—100 мкм [25, 27]. Однако для более детального изучения облученных световым источником клеток, например, динамиче-
0
Рис. 3. Фотошаблон: (а) общий вид (объектив 10х), размеры частиц: 1 — 100, 2 — 50, 3 — 10, 4 — 5, 5 — 1 мкм; расстояние между соседними частицами 6 — 100 мкм; (б) "микрочастицы" 4 и 5 для 40х-объектива.
ских процессов в области мембраны сенсибилизированной жировой клетки или в области их межклеточного пространства с размерами порядка 3—4 мкм требуется большее пространственное разрешение, например, адекватное 90-кратному объективу.
Размеры ячеек камеры Горяева довольно велики (50 мкм), поэтому для оценки минимальных размеров реальных физических частиц, которые могут быть зарегистрированы используемыми цифровыми микроскопами, был изготовлен специальный фотошаблон с заданными размерами моделей частиц. Фотошаблон представлял собой стеклянную пластину, на одной из сторон которой методом электронной литографии были нанесены металлические полоски и квадраты разных размеров (рис. 3).
Из рис. 3а видно, что пространственное разрешение для 10-кратного объектива позволяет регистрировать металлическую полоску фотошаблона шириной до 1 мкм, однако квадрат фотошаблона со стороной того же размера различим весьма слабо. В то же время 40- и 90-кратные объективы позволяют уверенно регистрировать как металлическую полоску фотошаблона шириной 1 мкм, так и квадрат фотошаблона со стороной того же размера (рис. 3б). Оценки пространственного разрешения цифрового микроскопа на основе фотошаблона дают практически те же значения, что и эксперименты с камерой Горяева.
Отмеченное выше достаточное для регистрации эритроцитов пространственное разрешение цифрового микроскопа при 40-кратном объективе демонстрируется на рис. 4а. Легко видеть, что диаметр эритроцита (8 мкм) соответствует примерно 64 пкс. Это позволяет не только уверено визуализировать эритроцит, но и получить зависимость яркости изображения эритроцита В от координаты X в его поперечном сечении (В(Х), рис. 4б). Точки а, б, в на рис. 4а соответствуют гра-
X
В 160
120
80
40
(б)
0
10
15
20
X, мкм
В
200
100
(г)
а 1 1 б в 1 1
10
20
30
40
X, мкм
Рис. 4. Фото эритроцита (а) и эритроцитарного комплекса (в) при увеличении объектива 40х: линия а—в — прямая, вдоль которой определяется зависимость яркости В от координаты, кривые — зависимости яркости В от координаты прямой а—в для эритроцита (б) и агглютината (г).
а
5
0
Поле зрения, мкм 1000
600 -
200 -
10
30
50
70 90
Увеличение
Рис. 5. Поле зрения цифрового микроскопа в зависимости от увеличения его объектива: точки — эксперимент, кривая — аппроксимация.
ницам эритроцита и его центральной области соответственно. Расстояние между точками a и в на рис. 4а позволяет количественно оценить размер эритроцита. Ест
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.