НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 2, с. 128-134
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.858:615.214
ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И НЕЙРОРЕЦЕПТОРНЫЕ РАЗЛИЧИЯ МЫШЕЙ
ЛИНИЙ C57BL/6 И BALB/c
© 2013 г. Г. И. Ковалёв*, Е. А. Кондрахин, Р. М. Салимов
ФГБУ "НИИфармакологии имени В.В. Закусова"РАМН, Москва
Изучены в сравнительном плане спонтанное поведение инбредных мышей C57BL/6 и BALB/c в тесте "крестообразный лабиринт" и нейрорецепторные характеристики их мозга. Корреляционный и факторный анализы показателей поведения в условиях новой обстановки указывают на достаточную независимость исследовательской активности и уровня тревожности мышей. Линия BALB/c обнаруживает меньшую степень исследовательской способности и более высокий уровень тревожности. Плотность (Вшах, фмоль/мг белка) ММБА-рецепторов в гиппокампе и бензодиазепиновых рецепторов в префронтальной коре оказалась выше у мышей C57BL/6. Совокупность данных указывает на возможность селективной фармакологической регуляции когнитивного поведения и тревожности с помощью ноотропных и анксиолитических лекарственных средств.
Ключевые слова: ИМБЛ-рецептор, бензодиазепиновый рецептор, крестообразный лабиринт, радиоли-гандное связывание, исследовательское поведение, тревожность, корреляционный анализ.
Б01: 10.7868/81027813313020040
ВВЕДЕНИЕ
Исследовательское поведение лабораторных животных включает в себя разнородные показатели, отражающие, в частности, уровень двигательной активности, когнитивной деятельности и тревожности по отношению к новой обстановке, которые могут использоваться при оценке профиля активности фармакологических средств. Нейроре-цепторные показатели такие, как плотность рецепторов и константа диссоциации лиганд-рецеп-торного комплекса представляют собой следующий этап в оценке параметров эффективности препаратов. При этом индивидуально-типологические особенности животных вносят значительный вклад в выраженность указанных видов поведения, биохимических параметров и чувствительности к фармакологическим средствам [1, 2]. Различия в поведении были установлены на примере мышей инбредных линий БАЬБ/е и С57БЬ/6, которые характеризуются различным типом эмоционально-стрессовой реакции и проявляют неодинаковую чувствительность к веществам, обладающим анксиолитическим действием [3, 4]. В дальнейших исследованиях было установлено, что исследовательское поведение лабораторных животных имеет неодинаковую чувствительность и к другим соединениям, в частности, к на-локсону и пирацетаму. Антагонист опиатных
* Адресат для корреспонденции: 125315 Москва, ул.Балтий-ская, 8, тел.: (495) 601-20-51; e-mail: geo-kovalev@yandex.ru.
рецепторов налоксон оказывал разнонаправленное влияние на активность мышей линии БАЬБ/е и С57БЬ/6 в тесте открытого поля [5]. В отношении пирацетама известно, что его ноотропное действие проявляется в увеличении упорядоченности исследовательского поведения в крестообразном лабиринте, увеличении количества мест связывания для ММЭА-рецепторов у аутбредных мышей линии 1СЯ с низкой эффективностью исследовательского поведения и зависит от выраженности спонтанного дефицита этого поведения [2]. Однако, поскольку указанные эксперименты с пираце-тамом были выполнены только на одной линии аутбредных мышей, остается неизвестным, в какой степени влияние пирацетама на когнитивные компоненты исследовательского поведения и ре-цепторные характеристики может зависеть от индивидуально-типологических различий реакции линейных животных на новую обстановку, связанных с тревожностью, и иных физиологических особенностей.
Настоящее исследование имело целью изучение поведенческих и нейрорецепторных межлинейных различий у мышей БАЬБ/е и С57БЬ/6. Выбор упомянутых инбредных линий мышей связан с тем, что мыши линии БАЬБ/е имеют преимущественно пассивный фенотип поведения в эмоционально значимой ситуации и характеризуются менее выраженной исследовательской реакцией в тесте открытого поля по сравнению с мышами линии С57БЬ/6, которые проявляют преимуще-
ственно активный фенотип эмоционально-стрессовой реакции [4, 6, 7].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Исследование эффективности исследовательского поведения по методике крестообразного лабиринта. Исследовательское поведение и тревожность оценивали в крестообразном лабиринте [8]. Исследования проводили на самцах мышей линий BALB/c (n = 45) и C57BL/6 (n = 43), полученных из питомника "Столбовая", массой 23—25 г, которых содержали в виварии ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН в стандартных условиях при свободном доступе к воде и корму.
Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0. Рассчитывали коэффициенты корреляции Пирсона, а для рангового показателя тревожности линии мышей дополнительно рассчитывали непараметрическую корреляцию Спирмена. Выполняли также факторный анализ корреляций (метод главных компонент), который учитывал собственные значения факторов больше 1 и использовал нормализованную процедуру вращения факторов Varimax (существенными считались нагрузки величиной выше 0.5). Для анализа поведения контрольных мышей, получавших инъекции плацебо, использовали 1-уров-невый дисперсионный анализ [9] (независимой переменной являлась линия мышей).
В качестве дополнительного показателя использовали условный ранг тревожности линии мышей, который присваивали в связи с известной принадлежностью использовавшейся линии к активному (C57BL/6) и пассивному (BALB/c) фенотипу и равный соответственно 1 и 2 [4, 6, 7].
После сессии в лабиринте у мышей извлекали и замораживали структуры головного мозга в жидком азоте для последующего радиолигандно-го анализа с бензодиазепиновыми и NMDA-ре-цепторами. Результаты экспериментов ex vivo оценивали с помощью рассчитанных величин Kd и Bmax, отражающих степень сродства рецептора к лиганду (нМ) и количество мест связывания ли-ганда (фмоль/мг белка) соответственно.
2. Тест исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте. Крестообразный лабиринт состоял из 4-х прозрачных пластмассовых закрытых пустых отсеков, которые имели номера 1—4 и соединялись с таким же центральным отсеком с помощью входных отверстий. Пол лабиринта очищали перед каждым опытом. Животное помещали в центральный отсек и позволяли ему обследовать лабиринт. Фактически лабиринт — структурированный аналог теста открытого поля, который в отличие от последнего допускал количе-
ственное измерение исследовательского поведения животного независимо от величины его двигательной активности. С помощью персонального компьютера регистрировали последовательность перемещений животного и продолжительность его пребывания в разных частях лабиринта. Критерием захода в отсек лабиринта считалось наличие всех четырех лап животного внутри этого помещения. Эксперимент продолжался до тех пор, пока животное не совершит 12 переходов из одного бокового отсека в другой (т. е. пока оно не совершит 13 визитов в боковые отсеки). Последующий анализ данных позволял выделить следующие показатели.
1. Латентный период начала исследовательского поведения ^_СИТт), то есть время, прошедшее до первого захода в боковой отсек, и продолжительность пребывания в первом тупике (F_GlTm). Эти параметры имеют отрицательную корреляцию с продолжительностью пребывания в открытых рукавах приподнятого лабиринта и могут рассматриваться как показатель баланса между любопытством и тревогой животного в новой обстановке.
2. Число визитов в боковые отсеки во время первого и второго патрулирования лабиринта (то есть посещения всех его помещений) ^_Р1гМ). Например, если последовательность номеров посещенных боковых отсеков была 1241413344321, то на первое патрулирование было затрачено 7 визитов. Чем больше визитов требуется для полного обхода лабиринта, тем менее эффективно — исследовательское поведение данной особи.
3. Общее число патрулирований (РаЫМ). В вышеприведенном примере этот показатель равен 2, поскольку второе патрулирование было завершено на 13-м визите. Чем больше наблюдалось патрулирований лабиринта, тем более эффективно исследовательское поведение данного животного.
4. Общая продолжительность пребывания в центре и рукавах лабиринта после 1-го захода в боковой отсек (на основании которых вычисляли соответствующие средние показатели Мп_СИш и Mn_GlTm), которая имеет обратную корреляцию с числом пересеченных квадратов в тесте открытого поля.
Для описания исследовательской активности был введен нормированный параметр, который является совокупностью двух главных параметров исследовательской активности крестообразного лабиринта — параметра числа визитов в боковые отсеки во время первого патрулирования и общего числа патрулирований. Расчет нормированного параметра проводили путем среднеарифметической суммы данных показателей, при этом вклад каждого из них был равноценен. Формула расчета нормированного параметра =((100-(чис-
ло визитов первого патрулирования-4)*11.111)+ + общее число патрулирований *33.33)/2. Показателем тревожности служил латентный период до первого захода в рукав лабиринта.
3. Связывание с NMDA-рецепторами. а) Выделение плазматических мембран гиппокампа проводили по методу [10]. Гиппокампы размельчали в гомогенизаторе "тефлон-стекло" в 10 объемах буфера № 1 (5mM HEPES, 4.5 mM Tris, 0.32 M Сахароза, рН 7.6). Гомогенат разбавляли 50 объемами буфера № 2 (5mM HEPES, 4.5 mM Tris, рН 7.6) и центрифугировали при 1000 g 10 мин на ультрацентрифуге Beckman L7-35. Супернатант сливали и повторно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Для увеличения выхода белка супернатант откручивали дважды. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 2 и центрифугировали при 8000 g 20 мин. Супернатант и верхний коричневый осадочный слой сливали и центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 3 (5mM HEPES, 4.5 mM Tris, 1 mM Na4EDTA, рН 7.6) и троекратно центрифугировали при 25 000 g 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объемах буфера № 2 и однократно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Конечный осадок сохраняли в 5 объемах буфера № 2 и замораживали в крио-пробирках в жидком азо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.