НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 1, с. 52-59
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.822
ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ МОДИФИЦИРУЕТ АКТИВНОСТЬ МИТОГЕН-АКТИВИРУЕМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ И ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА С-JUN В ГИППОКАМПЕ КРЫС ВСЛЕД ЗА ТЯЖЕЛОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЕЙ
© 2007 г. М. О. Самойлов, Е. А. Рыбникова, Н. А. Ситник, Т. С. Глущенко,
Е. И. Тшлькова*, Л. Н. Гринкевич
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
С использованием методов количественной иммуноцитохимии и Вестерн-блот-анализа исследовали влияние прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией на изменения активности митоген-активируемых протеинкиназ ERK, JNK1/2, p38 и транскрипционного фактора c-Jun в гип-покампе крыс в ответ на тяжелую гипоксию. Тяжелая повреждающая гипобарическая гипоксия устойчиво активировала в клетках гиппокампа JNK каскад, включающий JNK1/2 и c-Jun, а также киназу р38. Используемое прекондиционирующее воздействие эффективно подавляло экспрессию фосфорилированных форм JNK, c-Jun, р38 и активировало протеинкиназу ERK вслед за тяжелой гипоксией, что очевидно, способствует выживанию нейронов гиппокампа. Полученные данные свидетельствуют о важной роли семейства митоген-активируемых протеинкиназ и транскрипционного фактора c-Jun в процессах гибели/выживания нейронов гиппокампа вслед за тяжелой гипобарической гипоксией и о выраженном корректирующем эффекте используемого прекондиционирующе-го воздействия.
Ключевые слова: гипобарическая гипоксия, прекондиционирование, митоген-активируемые про-теинкиназы, транскрипционный фактор с-Jun.
Митоген-активируемым протеинкиназам (МАРК) принадлежит важная роль в сигнальной трансдукции от поверхности клеток в ядро и регуляции клеточной смерти или выживания [1]. К основным компонентам суперсемейства MAPK относятся extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal protein kinase (JNK) и p38. Предполагается, что эти киназы вовлекаются как в дегенеративные, так и в протективные процессы в клетках мозга в ответ на ишемию/гипоксию, ок-сидативный стресс и другие стрессорные воздействия [2, 3]. Информационный трансфер киназа-ми иерархично организован каскадами киназ, и некоторые из них могут активизироваться параллельно (например, такие как JNK и ERK). Финальный исход (смерть или переживание клеток) зависит от изменения соотношения про- и антидегенеративных внутриклеточных программ с участием MAPK [4]. Полагают, что ERK играют важную роль в процессах пролиферации и выживания клеток, а JNK и р38 - в механизмах регуляции апоптоза и дегенерации клеток [2]. ERK активизируются в ответ на факторы роста [5], оксида-тивный стресс [6], увеличение внутриклеточного
* Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6. Тел. (812)328-13-01, Факс: (812)328-05-01, e-mail: mos@kolt.infran.ru
Са2+ или стимуляцию глутаматных рецепторов [7, 8]. Фосфорилирование ERK связано с индукцией ранних генов, а также транскрипционных факторов CREB, Elk-1 [9].
Стресс-активируемые киназы JNK и р38 индуцируются цитокинами, активными формами кислорода, различными стрессорными воздействиями [3, 4]. Фосфорилирование р38 вызывает активацию транскрипционного фактора ATF-2 [10]. Роль р38 в нервной системе до сих пор недостаточно понятна, но его активация является частью ответа клеток на стресс, возможно, эта киназа вовлекается в апоптоз[4]. Основными субстратами JNK являются c-Jun, р53, белки семейства генов bcl-2 [3]. На транскрипционном уровне JNK может запускать индукцию эффекторов апоптоза р53 и Fаs-лигандов путем фосфорилирования с-Jun [4]. С-Jun относят к ключевым эффекторам смерти клеток. Полагают, что устойчивая активация JNK и/или противоположные изменения активности ERK and JNK вносят вклад в развитие апоптоза [3, 11, 12]. JNK может индуцировать апоптоз после транслокации в митохондрии путем фосфорилирования и активации проапопто-тических белков Bax, Bad и ингибирования антиа-поптотических белков Bcl-2 [3, 4]. Таким образом, очевидно, JNK принадлежит ключевая роль
в контроле путей апоптоза, связанных с рецепторами смерти и митохондриями [13].
На основании результатов многочисленных исследований, выполненных в последние годы, предполагается, что сигнальные пути MAPK могут быть в значительной степени ответственны за повреждения нейронов мозга после ишемии. Выявлены две волны повышения активности JNK в чувствительной области гиппокампа СА1 через 5-30 мин и 48-72 часа вслед за тяжелой ишемией [1, 14-16]. Обнаружена устойчивая экспрессия (от 3 до 72 ч) фосфорилированной формы c-Jun (рс-Jun) в СА1 вслед за ишемией [16-19]. В ряде работ показаны изменения экспрессии р38 и ERK вслед за ишемией в гиппокампе и неокортексе [1, 12, 19-28]. Эти данные неоднозначны и в некоторых случаях противоречивы, что, вероятно, связано с использованием различных экспериментальных моделей. Но вместе с тем показаны увеличение экспрессии фосфорилированной ERK ^ERK) в более устойчивых образованиях гиппокампа (СА3, зубчатая извилина) и ее подавление или отсутствие изменений в уязвимой области СА1 вслед за ишемией [19, 22, 26, 28]. Интересные результаты получены в экспериментах с использованием ишемического прекондициониро-вания, повышающего толерантность нейронов мозга к летальной ишемии. В этих экспериментах установлено подавление экспрессии мРНк JNK и c-Jun в СА1 после тяжелой ишемии [1, 26-30]. Наряду с этим обнаружено, что само прекондицио-нирование приводит к устойчивому повышению активности ERK в СА1 [1, 26, 28, 31] и в неокортексе in vitro [32].
Практически отсутствуют сведения о влиянии различных видов гипоксии на активность MAPK каскадов в мозге in vivo. Ранее нами при использовании моделей гипобарической гипоксии в различных режимах (тяжелой повреждающей и прекон-диционирующей) показано, что прекондициониро-вание существенно повышает резистентность нейронов гиппокампа и неокортекса [33], нивелирует нарушения обучения, памяти, поведения крыс [34-36] вслед за тяжелой гипоксией. Наряду с этим прекондиционирование модифицирует экспрессию ранних генов и их продуктов - белков NGFI-A, c-Fos [33, 36, 37], пептидных антиокси-дантов (тиоредоксинов-1.2, супероксиддисмутаз) [38-40], про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 [41, 42] в переднем мозге (гиппокампе, неокортексе) вслед за тяжелой гипобари-ческой гипоксией.
Цель работы - изучение экспрессии и распределения фосфорилированных форм MAPK ^JNK1/2, р-р38, рERK) и с-jun в гиппокампе вслед за тяжелой гипобарической гипоксией у не- и прекондиционированных крыс.
МЕТОДИКА
Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар (весом 200-220 г), которые подвергались гипобарической гипоксии в различных режимах в барокамере проточного типа. Одна группа крыс испытывала тяжелое гипоксическое воздействие (давление в барокамере поддерживали в течение 3 ч на величине 180 мм рт. ст., соответствующей "подъему" на высоту 11000 м). У другой группы крыс такой процедуре предшествовало трехкратное умеренное (прекондиционирую-щее) гипоксическое воздействие длительностью по 2 ч с 24-часовым интервалом (давление в барокамере поддерживали на величине 360 мм рт. ст., что соответствует "подъему" на высоту 5000 м). Спустя сутки вслед за последним сеансом прекон-диционирования этих животных подвергали тяжелому гипоксическому воздействию. Такой способ прекондиционирования существенно понижал смертность животных при предъявлении тяжелой гипоксии (средняя выживаемость непре-кондиционированных животных, подвергавшихся действию тяжелой гипоксии, составляла 50%, а прекондиционированных - 85%).
Экспрессию МАРК изучали методами количественной иммуноцитохимии и Вестерн-блот анализа в период 30 мин - 72 ч после тяжелой гипоксии. Для иммуноцитохимии ткани фиксировали путем транскардиальной перфузии 4%-ного пара-формальдегида, затем животных декапитирова-ли, извлеченный мозг постфиксировали в течение 1 ч, после чего переносили в 20%-ный раствор сахарозы и хранили не более месяца. Работа выполнена на замороженных срезах области гиппокампа толщиной 11 мкм. Иммуноцитохимия проведена по стандартной методике с использованием поликлональных антител к рJNK1/2 (1:100, Santa Cruz Biotechnology, USA), pc-Jun (1:100, Santa Cruz Biotechnology, USA), pERK (1:100, Santa Cruz Biotechnology, USA), р-р38 (1:100, Santa Cruz Biotechnology, USA) и системы детекции Rabbit ABC Staining System (Santa Cruz Biotechnology, USA).
В иммуноцитохимических исследованиях уровень экспрессии белков определяли в Аммоновом роге (областях СА1-СА4) гиппокампа. Оценка изменений экспрессии проводилась с помощью системы компьютерного анализа изображения, включающей световой микроскоп Jenaval (Carl Zeiss, Germany), цифровую камеру Baumer CX05c (Baumer Optronic, Germany), компьютер и программное обеспечение Video Test Master Morphology. Анализировали общее число иммунореак-тивных клеток, а также, в ряде случаев, число сильно иммунореактивных клеток. Результаты статистически обрабатывали с помощью пакета анализа данных Statistica (StatSoft Inc., USA), критерия Стьюдента (р < 0.05). Все количественные результаты представлены в виде среднего ариф-
П Г П Г К А
30 мин. 72 часа
% от контроля 600 г
актин Б
500 400 300 200 100 0
а
fhM
к
30 мин 72 часа 30 мин 72 часа 30 мин 72 часа 30 мин 72 часа
CA1
CA2
CA3
CA4
Рис. 1. Эффект прекондиционированной и непрекон-диционированной тяжелой гипобарической гипоксии на экспрессию фосфорилированной JNK (pJNK) в гиппокампе крыс. А, Вестерн-блот-анализ, Б, имму-ноцитохимия. К - контроль; П - прекондиционирова-ние; Г - гипоксия. На графиках: светлые столбики -контроль, черные столбики - тяжелая гипоксия, заштрихованные столбики - прекондиционированная тяжелая гипоксия, 30 мин, 72 ч - время после воздействия тяжелой гипоксии. * - различия достоверны по отношению к контролю, # - различия достоверны по отношению к тяжелой гипоксии.
метического. Каждая экспериментальная группа включала 5-6 крыс.
Для изучения активации МАРК применяли метод Вестерн- блот-гибридизационного анализа с использованием антител к фосфорилированным формам JNK и р38. Крыс декапитировали и быстро извлекали прав
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.