НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 3, с. 208-212
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8
РАЗВИТИЕ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОВОГО КИНДЛИНГА У КРЫС СОПРОВОЖДАЕТСЯ УВЕЛИЧЕНИЕМ ЭКСПРЕССИИ ДАБЛКОРТИНА В ГИППОКАМПЕ
© 2009 г. В. А. Аниол*, А. А. Яковлев, М. Ю. Степаничев, Н. А. Лазарева, Н. В. Гуляева
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Даблкортин - белок с молекулярной массой 50 кДа, который экспрессируется в нейронах на ранних стадиях дифференцировки. В работе проведено исследование экспрессии даблкортина в гиппокам-пе крыс при хроническом введении пентилентетразола. Крыс декапитировали после 1, 3, 5 и 13 инъекций подпороговой дозы хемоконвульсанта и содержание даблкортина оценивали с помощью Western-blot-анализа. Установлено, что в гиппокампе антитела к даблкортину взаимодействовали с белками с молекулярной массой 50 и 70 кДа. Экспрессия даблкортина повышалась после 13 инъекций пентилентетразола, что свидетельствует об интенсификации процессов нейрогенеза в гиппокампе крыс с повышенной судорожной готовностью. Белки массой 70 кДа были обнаружены в коре и гиппокампе, и изменение их экспрессии не было связано с изменением экспрессии даблкортина.
Ключевые слова: гиппокамп, нейрогенез, даблкортин, пентилентетразол, эпилепсия.
ВВЕДЕНИЕ
Процесс постоянного образования новых клеток в гиппокампе взрослых млекопитающих был впервые открыт Altman и соавт. в 60-х годах XX в. [1-3]. За полвека, прошедшие с тех пор, было установлено, что часть этих клеток становится нейронами и встраивается в существующие ней-рональные сети гиппокампа, а часть дает начало глии. Как само образование новых клеток, так и процесс их дифференцировки в нейроны или глию находится под регулирующим воздействием разнообразных внешних и внутренних факторов. Одним из таких факторов является судорожная активность. Были высказаны предположения о вкладе постнатального нейрогенеза в процессы развития судорожных состояний, что стимулировало исследования в этой области. В ряде работ было показано, что судороги, вызванные введением хемоконвульсантов или электрическим раздражением проэпилептогенных участков мозга, сопровождаются усилением пролиферации клеток в гиппокампе и увеличением числа молодых нейронов в нем [4, 5]. Наряду с этим существуют работы, в которых демонстрировалась возможность ослабления нейрогенеза на фоне судорожной активности [6, 7]. Имеющиеся противоречия могут быть связаны с различными экспериментальными подходами к выработке судорог, а также с затруднениями интерпретации результатов двойного окрашивания с использованием марке-
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а; e-mail: aniviktor@narod.ru
ров зрелых нейронов. Наряду с этим существуют белки, присутствующие только в незрелых, молодых нейронах, что позволяет по уровню их экспрессии напрямую определять интенсивность нейрогенеза. Одним из таких маркеров является даблкортин ^оиЫесогйп), представляющий собой белок, ассоциированный с микротрубочками ней-робластов и незрелых нейронов и опосредующий процессы их миграции. Даблкортин экспрессируется в нейробластах и незрелых нейронах в течение нескольких недель после их образования [8]. Процесс созревания нейрона, его встраивание в гранулярный слой зубчатой фасции, ветвление дендритов и установление синаптической связи с пирамидными клетками поля СА3 сопровождается постепенным исчезновением экспрессии даблкортина. Зрелые нейроны гранулярного слоя зубчатой фасции уже не экспрессируют даблкортин. В связи с этим даблкортин может быть использован в качестве маркера незрелых нейронов, что позволит изучать процессы постнатального нейрогенеза. В настоящем исследовании мы определяли экспрессию даблкортина в гиппокампе крыс на разных этапах пентилентетразолового киндлинга (ПТЗК), являющегося общепринятой моделью эпилептогенеза и хронической судорожной активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для выработки ПТЗК было использовано 35 самцов крыс линии Wistar в возрасте 2 мес массой тела 150-200 г к началу эксперимента. Крыс
РАЗВИТИЕ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОВОГО КИНДЛИНГА
209
содержали по пять особей в пластмассовых клетках при искусственном световом режиме (день 8 : 0020 : 00) и свободном доступе к воде и пище. Для оценки экспрессии даблкортина в гиппокампе животных на разных стадиях развития ПТЗК было сформировано 5 групп: контрольная (n = 8) и 4 подопытных группы, которым вводили ПТЗ внутрибрюшинно в дозе 37.5 мг/кг массы тела 1, 3, 5 и 13 раз (n = 6-7). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили изотонический раствор NaCl. Введение пентилентетразола (ПТЗ) осуществляли каждые вторые сутки с перерывом на выходные дни в одно и то же время (11 : 00). В течение 20 мин после инъекции ПТЗ оценивали судорожную активность животных в баллах, как описано ранее [9].
На следующий день после последнего введения ПТЗ животных декапитировали, извлекали головной мозг, затем выделяли гиппокамп и замораживали его в жидком азоте до использования. Для выделения белковой фракции гиппокамп гомогенизировали в Тризоле в соотношении 1 г на 15 мл, после чего из полученного гомогена-та выделяли белковую фракцию методом фенол-хлороформной экстракции. Затем определяли концентрацию белка в каждой пробе по методу Брэдфорд [10] при помощи спектрофотометра Ultrospec II (LKB Biochrom, UK). После этого разводили все образцы до одинаковой концентрации белка 6 мг/мл. Пробы денатурировали кипячением в буферном растворе и наносили на полиакри-ламидный гель (содержание акриламида 10% для определения даблкортина и 12% для определения а-тубулина). Затем белки переносили с геля на нитроцеллюлозную мембрану и далее обрабатывали по стандартной методике Western-blot. Для определения даблкортина применяли первичные поликлональные антитела кролика к даблкорти-ну (1 : 2000; Abcam, UK) и вторичные антитела козы к IgG кролика, конъюгированные с перокси-дазой хрена (1 : 1000; Bio-Rad Laboratories, USA). Для определения а-тубулина применяли первичные моноклональные антитела мыши к а-тубу-лину (1 : 20000; Sigma, USA) и вторичные антитела козы к IgG мыши, конъюгированные с перок-сидазой хрена (1 : 1000; Bio-Rad Laboratories, USA). Проявку проводили методом люминолзависимой хемилюминесценции, результаты фиксировали на фотопленке и обрабатывали при помощи программы Total Lab. Результаты анализа содержания даблкортина нормировали по а-тубулину для каждого животного. Статистическую обработку и анализ результатов проводили при помощи пакета программ "Statistica for Windows". Данные представлены в виде M ± S.E.M.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Хроническое введение ПТЗ крысам приводит к развитию киндлинга, сопровождающегося повышением судорожной готовности и усилением конвульсивных проявлений в ответ на каждую последующую инъекцию ПТЗ. В настоящем исследовании наблюдалось усиление внешних судорожных проявлений с 1.93 ± 0.05 баллов после первой инъекции ПТЗ до 3.05 ± 0.05 баллов после последней инъекции ПТЗ.
Ход процессов созревания молодых клеток, образовавшихся в зубчатой фасции гиппокампа, можно проследить по экспрессии ими различных белков, характерных для разных стадий диффе-ренцировки. Недифференцированные мультипо-тентные клетки экспрессируют маркер астроци-тарной глии - глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP). Вступление клетки на путь нейро-нальной дифференцировки сопровождается исчезновением GFAP и появлением наиболее раннего маркера нейрональной дифференцировки -даблкортина, экспрессирующегося в нейробла-стах и незрелых нейронах примерно с 4-х по 26-е сут развития [11]. В это время клетка мигрирует из субгранулярного слоя зубчатой фасции в гранулярный и там встраивается в нейрональную сеть, протягивая дендрит в молекулярный слой, а аксон - в поле CA3 и устанавливая синаптические контакты. Зрелый нейрон перестает экспресси-ровать даблкортин, на смену которому постепенно приходят белки, характерные для взрослого гранулярного нейрона - NeuN и кальбиндин [8]. Таким образом, измерение уровня даблкортина в гиппокампе позволяет оценить число молодых, недавно образовавшихся клеток, уже вступивших на нейрональный путь дифференцировки, но еще не достигших стадии зрелого нейрона.
Даблкортин обычно выявляется при иммуно-гистохимическом окрашивании срезов мозга контрольной крысы в некоторых клетках гранулярного слоя зубчатой фасции (рис 1А). Даблкортин был локализован в цитоплазме клеток, но не в их ядре. Окрашивались также отростки клеток в молекулярном слое зубчатой фасции. В системе боковых желудочков и рострального миграционного русла также отмечалось интенсивное окрашивание клеток и их отростков (рис 1Б). В остальных областях мозга положительного окрашивания на даблкортин обнаружено не было.
Уровень экспрессии даблкортина в отделах мозга исследовали с помощью Western-Ыot-анали-за. В экстрактах гиппокампа крыс всех групп было обнаружено две полосы, примерно соответ-
Рис. 1. Окрашивание клеток, экспрессирующих даблкортин, в гранулярном слое зубчатой фасции (ЗФ) гиппокампа крыс (A) и в субвентрикулярной области боковых желудочков (Б) непрямым иммунопероксидазным методом. А. Даблкортин локализован в цитоплазме и отростках клеток, расположенных на границе гранулярного слоя ЗФ и поля СА4 гиппокампа. Б. Клетки, экспрессирующие даблкортин (отмечены стрелками), расположены в толще суб-вентрикулярного слоя. Окраска поликлональными антителами кролика к даблкортину (1 : 500; Abcam, UK), антителами козы к IgG кролика, конъюгированными с биотином (1 : 800; Sigma, USA), и стрептавидин-пероксидазным комплексом (1 : 100; Имтек, Россия). Об. х40, ок. х10.
контроль ПТЗ 1 ПТЗ 3 ПТЗ 5 ПТЗ 13 кора
Рис. 2. Экспрессия даблкортина (Dcx) в гиппокампе крыс на разных стадиях ПТЗК (контроль-ПТЗ 13). В экстрактах гиппокампа антителами к Dcx выкрашивались две полосы в области 50 и 70 кДа. Даблкортину соответствовала полоса 50 кДа. В неокортексе присутствовала лишь полоса в области 70 кДа.
ствующие фракциям белков с молекулярной массой 50 и 70 кДа (рис. 2). Полоса 50 кДа соответствует даблкортину. Предполагается, что полоса 70 кДа может принадлежать комплексу дабл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.