НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 4, с. 311-317
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.175.82
СОСТОЯНИЕ ТУБЕРОИНФУНДИБУЛЯРНОЙ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПАРКИНСОНИЗМА У МЫШЕЙ © 2012 г. Е. А. Дегтярева1,2, *, Т. С. Пронина1,2, М. В. Угрюмов1,2
Лаборатория гормональных регуляций, Учреждение российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 2Лаборатория нейрогистологии им. Б.И. Лаврентьева, Государственное учреждение Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН
Одним из наиболее широко распространенных нейродегенеративных заболеваний является болезнь Паркинсона (БП), развивающаяся в результате гибели дофаминергических (ДА-ергических) нейронов нигростриатной системы мозга. При этом на аутопсийном материале показано, что ней-родегенеративный процесс распространяется и на другие популяции нейронов — на периферии и в мозгу. В частности, оказалось, что при БП у пациентов деградирует и тубероинфундибулярная ДА-ергическая система (ТИДАС), однако воспроизвести сочетанную деградацию нигростриатной системы и ТИДАС на экспериментальных моделях пока не удалось. Поэтому цель данной работы — анализ состояния ТИДАС у мышей при моделировании с помощью нейротоксина 1-метил-4-фе-нил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) досимптомной и симптомной стадий паркинсонизма, развивающихся соответственно в результате подпороговой и пороговой деградации нигростриат-ной ДА-ергической системы. Для оценки морфо-функционального состояния ТИДАС определяли:
(а) количество нейронов, содержащих тирозингидроксилазу (ТГ) — ключевой фермент синтеза ДА,
(б) размер терминалей ТГ-иммунореактивных аксонов, (в) содержание ТГ в телах и терминалях аксонов нейронов, (г) содержание ДА, норадреналина и 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты. Согласно полученным данным на досимптомной стадии паркинсонизма в ТИДАС отсутствовали изменения по всем показателям, а на симптомной стадии наблюдалось: (а) снижение содержания ДА на 50%, (б) снижение уровня ТГ белка в терминалях аксонов и увеличение в телах нейронов, (в) увеличение "кругооборота" (turnover) ДА на 149% по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о функциональной недостаточности ТИДАС, проявляющейся в изменении метаболизма ДА — снижении уровня синтеза, скорее всего в терминалях аксонов, и в компенсаторном ускорении функционального цикла — от синтеза до ферментативной деградации. Хотя в ТИДАС не было обнаружено изменения количества нейронов и аксонов, содержащих ТГ, вопрос об органической деградации ТИДАС при паркинсонизме остается открытым, поскольку ТГ является маркером не только ДА-ергических нейронов, дегенерирующих под действием нейротоксинов, но и недофа-минергических нейронов, нечувствительных к нейротоксинам. Таким образом, при экспериментальном моделировании паркинсонизма обнаружены, по крайней мере, метаболические признаки деградации ТИДАС, причем, только на симптомной стадии.
Ключевые слова: мозг, тубероинфундибулярная дофаминергическая система, нейрон, дофамин, тиро-зингидроксилаза, нейротоксин, болезнь Паркинсона.
ВВЕДЕНИЕ
Ключевым звеном патогенеза БП является дегенерация ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, что приводит к нарушению двигательной активности [1]. БП характеризуется длительным периодом развития без проявления симптомов благодаря включению механизмов пластичности мозга [2], что позволяет в течение длительного времени компенсировать функциональную недостаточность дегенерирующих нейронов. БП носит системный характер, затрагивая различные нейрональные системы и вызывая на-
* Адресат для корреспонденции: 119335, Москва, ул. Вавилова 26, тел./факс: (499) 135-88-42, e-mail: degtyareva.ka@gmail.com.
рушения функций не только на уровне мозга, но и на периферии [1, 3]. Так, наряду с дегенерацией нигростриатных ДА-ергических нейронов [1], также дегенерируют и норадренергические (НА-ерги-ческие) нейроны голубого пятна ствола мозга [3] и серотонинергические нейроны ядра шва [4]. При этом обнаружен временной градиент распространения нейродегенеративного процесса [5] и нарушения соответствующих немоторных функций [6].
Одной из областей мозга, деградирующих у человека при БП, является ТИДАС. Тела нейронов, образующих эту систему, располагаются в аркуат-ном ядре (АЯ), а их аксоны проецируются в срединное возвышение (СВ). Синтезирующийся в них ДА выделяется в гипофизарную портальную
систему циркуляции и оказывает ингибирующее влияние на секрецию пролактина гипофиза [7, 8]. У больных при БП как in vivo c помощью позитрон-но-эмиссионной томографии [9], так и ex vivo — на аутопсийном материале в гипоталамусе обнаружено уменьшение содержания ДА, НА и серотонина [10]. Более того, при изучении аутопсийного материала отмечено образование телец Леви — маркеров нейродегенеративного процесса [11]. Указанные органические и метаболические изменения ТИДАС нередко сопровождаются развитием ги-перпролактинемии [12, 13].
Несмотря на то, что системный характер БП не вызывает сомнения, до сих пор не ясно временное соотношение в развитии нейродегенеративных процессов при БП в нигростриатной ДА-ергиче-ской системе и в ТИДАС и региональные особенности их проявления, поскольку использованные ранее подходы позволяют оценивать патологический процесс, как правило, на конечной стадии заболевания. Поэтому цель данной работы — оценка состояния ТИДАС на недавно разработанных экспериментальных моделях досимптомной и симп-томной стадиях паркинсонизма [14]. Эти стадии воспроизводят у мышей подпороговую и пороговую дегенерацию ДА-ергических нейронов нигро-стриатной системы, вызванную системным введением 1 -метил-4- фенил-1,2,3, 6-тетрагидропириди-на (МФТП), превращающимся в мозгу в МФП+ — специфический токсин ДА-ергических нейронов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные, эксперименты. В работе использовано 30 самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 2— 2.5 мес., весом 22—26 г. Для воспроизведения досимптомной и симптомной стадий паркинсонизма животным подкожно вводили МФТП (Sigma, США) в дозе 12 мг/кг двукратно или четырехкратно с двухчасовым интервалом между инъекциями. Контрольным животным по такой же схеме вводили физраствор (0.9% NaCl) [14]. Через 14 дней после последней инъекции по 10 мышей из каждой группы декапитировали, извлекали мозг и выделяли комплекс "АЯ-СВ" в соответствии с атласом [15]. Для определения катехоламинов образцы нервной ткани замораживали в жидком азоте и хранили при температуре —70°С до проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией.
Остальных мышей (по 5 из каждой группы) подвергли транскардиальной перфузии 0.02 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (pH 7.2—7.4) в течение 15 мин при 37°С и затем 4%-ным парафор-мальдегидом на 0.2 М фосфатном буфере (pH 7.2— 7.4) в течение 10 мин при 4°С. После этого мышей декапитировали, выделяли мозг и фиксировали иммерсией в 4% параформальдегиде на 0.2 М фосфатном буфере 12 ч при 4°С. Затем мозг промыва-
ли в ФСБ 3 раза по 20 мин, инкубировали в 20%-ной сахарозе на ФСБ в течение 48 ч и замораживали в гексане, охлажденном до —40°С. Замороженный материал хранили при —70°С до проведения иммуногистохимии. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с национальными и международными требованиями и правилами, утвержденными комитетом по охране животных Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Биохимический анализ катехоламинов и их метаболитов. Для определения содержания ДА, НА, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) — продукта деградации ДА с помощью обратнофаз-ной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Amperomet-ric detector LC-4B, Bioanalytical Systems, США) кусочки нервной ткани гомогенизировали в 10 объемах 0.1 М HClO4 с внутренним стандартом 3,4-дигидроксибензиламином (250 пмоль/мл) при помощи ультразвукового гомогенизатора, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 мин. Пробы вводили в инжектор (Rheodyne 7125, США) с петлей объемом 20 мкл. Разделение производили на 10-сантиметровой колонке с внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18 (3.3 мкм) (Dr. Maisch GmbH, Германия). Пики катехолами-нов идентифицировали по времени выхода веществ в стандарте, используя программу Мульти-Хром 1.5 (Ampersand Ltd.). Результаты представлены в виде изменения содержания этих веществ в комплексе "АЯ-СВ" в опыте по отношению к контролю, принятому за 100%.
Иммуноцитохимия. Для пероксидазного моно-иммуномечения ТГ — первого скорость лимитирующего фермента синтеза ДА в ТИДАС на криоста-те Leica (Германия) приготавливали фронтальные серийные срезы комплекса "АЯ-СВ" (от bregma —1.46 до bregma —2.06) толщиной 14 мкм (всего 42 среза) и монтировали их на предметные стекла. Для иммуноцитохимического полуколичественного анализа на каждое стекло монтировали срезы контрольных и опытных животных. Затем срезы последовательно инкубировали: (а) с 3%-ным бычьим сывороточным альбумином (Sigma, США) и 0.3% Triton X100 (Triton-X100, Sigma, США) на ФСБ 30 мин при 22°С; (б) с кроличьими антителами к ТГ (1 : 1500) (предоставлены Ж. Тибо, Франция), 1%-ным бычьим сывороточным альбумином и 0.1% Triton X-100 на ФСБ в течение 24 ч при 22°С; (в) с биотинилированными антителами к антителам кролика (1 : 200) (Vector Laboratories, США) на ФСБ в течение двух часов при 22°С; и (г) с авидин-биотиновым комплексом, связанным с пероксидазой хрена (Vector Laboratories, США), на ФСБ в течение 1 ч при 22°С. После каждой инкубации, за исключением первой, срезы промывали в ФСБ в течение 30 м при 22°С. Пероксидазу авидин-биотинового комплекса выявляли путем
АЯ
/ж Ж->>
/ .'Ж Ж ■ %
' jRH^.-t.fe
• ' 4 * •*.< • »ч • >
/ Щ Ш \
/ дм ч
// ДМ
Рис. 1. Аркуатное ядро (АЯ) с условно выделенными вентролатеральной (ВЛ) и дорсомедиальной (ДМ) областями. а микрофото (объектив 20), б — схематическое изображение. СВ — срединное возвышение; 3ж — третий желудочек.
инкубации с 0.05% 3,3'-диаминобензидин тетро-гидрохлоридом (Sigma, США) и 0.01% H2O2 на ФСБ при 22°С под визуальным контролем, причем "проявление" срезов на всех стеклах осуществляли одновремен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.