ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ, 2015, том 118, № 6, с. 930-932
^^^^^^^^^^ СПЕКТРОСКОПИЯ
КОНДЕНСИРОВАННОГО СОСТОЯНИЯ
УДК 57.043;577.322.4
СПЕКТРАЛЬНО-ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИЗМЕНЕНИЯ КОНФОРМАЦИИ БЕЛКА БТШ70 В ПРОЦЕССЕ ТЕПЛОВОЙ ДЕНАТУРАЦИИ
© 2015 г. М. Н. Букина*, В. М. Бакулев*, А. В. Бармасов*, А. В. Жахов**, А. М. Ищенко**
* Санкт-Петербургский государственный университет, 199034 Санкт-Петербург, Россия ** Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов,
197110 Санкт-Петербург, Россия E-mail: mariabukina72@rambler.ru Поступила в редакцию 03.12.2014 г.
Исследованы спектрально-люминесцентные свойства водных растворов белка БТШ70, показана зависимость спектра испускания люминесценции от длины волны возбуждения, исследована зависимость интенсивности люминесценции тирозиновых и триптофановых остатков от температуры в диапазоне от 20 до 80°С. Люминесцентным методом определен температурный интервал (42—57°С), в котором происходит плавление белка. Увеличение квантового выхода флуоресценции триптофана и батохромный сдвиг спектра испускания денатурированной формы БТШ70 свидетельствуют о выходе триптофанилов на поверхность молекулы белка.
DOI: 10.7868/S0030403415060069
ВВЕДЕНИЕ
БТШ70 (Шр70) относится к семейству белков теплового шока, обладающих широким спектром клеточных функций, синтез которых значительно активируется при попадании организма или клетки в стрессовое состояние, вызванное повышением температуры, добавлением в клетку токсичных веществ и многими другими неблагоприятными факторами. Большая роль БТШ70 в жизнедеятельности клетки связана с его участием в фолдинге белков. Он также функционирует как стресс-белок, предотвращая агрегацию белков и восстанавливая поврежденные белки в ответ на клеточный стресс [1]. Кроме того, показано, что БТШ70 обладает иммуномодулирующими свойствами [2], в связи с этим сегодня ведутся активные фармакологические исследования новых противоопухолевых и противовирусных препаратов на базе данного белка [3]. Известно, что в на-тивном состоянии БТШ70 имеет два основных функциональных домена — М-концевой домен необходим для процесса гидролиза АТФ, а С-тер-минальный домен связывается с полипептидами. Однако вопрос о молекулярном механизме действия и третичной структуре БТШ70 до сих пор остается открытым [4].
Согласно данным о первичной структуре макромолекулы БТШ70, в его состав входят люми-несцирующие ароматические аминокислоты фе-нилаланин (25 остатков), тирозин (15 остатков) и триптофан (2 остатка). Люминесценция фенил-аланина не наблюдается в большинстве белков
вследствие низкого молярного коэффициента экстинкции и низкого квантового выхода. Форма и положение спектра люминесценции тирозина не изменяются при вхождении люминофора из раствора в макромолекулу, тогда как ее квантовый выход сильно снижается в результате различных процессов тушения, в том числе путем переноса энергии возбуждения на триптофан. По этим причинам люминесценция подавляющего большинства белков определяется входящими в их состав триптофанилами, спектрально-люминесцентные свойства которых проявляют сильную зависимость от физико-химических свойств окружения (наличие или отсутствие заряженных группировок, образование комплексов в возбужденном состоянии, микровязкость и т.п.). Поскольку в состав молекулы БТШ70 входит два триптофана, расположенные по одному в каждом функциональном концевом домене [5], появляется возможность использовать методы люминесцентной спектроскопии для получения дополнительных сведений о конформации белка. Анализ температурного тушения люминесценции может дать информацию о структурных перестройках макромолекулы.
МЕТОДИКА
В настоящей работе использовался высоко-очищенный (содержание больше 98%) рекомби-нантный человеческий белок БТШ70, наработанный с применением стандартной методики в
СПЕКТРАЛЬНО-ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ
931
Рис. 1. Спектр поглощения (1) и нормированные по максимуму интенсивности спектры люминесценции водного раствора БТШ70: 2 — спектр возбуждения при Хрег = 320 нм, 3 — спектр возбуждения при Хрег = 350 нм, 4 — спектр испускания при Хвозб = 260 нм, 5 — спектр испускания при Хвозб = 295 нм, 6 — спектр испускания после нагрева до 80°С и последующего охлаждения до комнатной температуры при Хвозб = 260 нм, 7 — спектр испускания люминесценции после нагрева до 80° С и последующего охлаждения до комнатной температуры при Хвозб = 295 нм.
ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов". Спектральные исследования препарата проводились в водных буферных растворах (бидистилли-рованная вода, 0.05 М Трис-НС1, рН = 6.5) при концентрации 0.5 мг/мл. Спектр поглощения регистрировался на спектрофотометре СФ-56 в 10 мм кварцевой кювете. Корректированные спектры испускания и возбуждения люминесценции и температурные зависимости интенсивности люминесценции растворов БТШ70 регистрировались на спектрофлуориметре ННаеЫ-850. Термостатирование кюветы осуществлялось с помощью дополнительно встроенного в кювет-ное отделение элемента Пельтье с точностью до 0.5°С. Относительный квантовый выход люминесценции БТШ70 определялся по стандартной методике, описанной Паркером [6]. В качестве эталонного образца использовался триптофан в нейтральном (рН 7) водном растворе при 20° С (ФД = 0.20 [7]).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Спектр поглощения БТШ70 в области первой полосы поглощения ароматических аминокислот (>240 нм) регистрируется в виде неструктурированного плеча на фоне более коротковолнового высокоинтенсивного перехода в возбужденные состояния других компонентов полинуклеотид-ной цепи (рис. 1, кривая 1). Разложение спектра на полосы отдельных хромофоров можно произвести только с помощью вычислительных алгоритмов [5]. В спектрах возбуждения удалось вы-
явить характерные полосы, связанные с поглощением тирозина (максимум 275 нм) и триптофана (максимум 280 нм), выбирая разные длины волн регистрации (рис. 1, кривые 2 и 3 соответственно).
Зависимость спектра испускания люминесценции БТШ70 от длины волны возбуждения свидетельствует о наличии в макромолекуле нескольких типов флуорофоров. Так, при возбуждении 260 нм спектр испускания имеет максимум на 303 нм (рис. 1, кривая 4), что соответствует люминесценции тирозиновых остатков в белках [8]. Люминесценция триптофана при таком возбуждении проявляется только в виде плеча. При возбуждении на 295 нм, где тирозин уже не поглощает, в спектре испускания наблюдается только люминесценция триптофана с максимумом на 333 нм (рис. 1, кривая 5).
Согласно литературным данным [8], максимум спектра испускания триптофана в водных растворах белков расположен в области от 330 до 350 нм в зависимости от микроокружения люминофора. Наиболее коротковолновое положение соответствует триптофану внутри белковой глобулы в низкополярном гидрофобном окружении. В этом случае регистрируется низкий квантовый выход люминесценции. Если триптофан находится на поверхности белка, в высокополярном водном окружении — максимум спектра испускания сдвигается в длинноволновую область (340— 350 нм), и квантовый выход люминесценции возрастает. Для спектров испускания люминесценции водного раствора БТШ70 в нативном состоянии характерна коротковолновая триптофановая люминесценция (максимум 333 нм) с низким
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ том 118 № 6 2015
4*
932
БУКИНА и др.
Интенсивность, отн. ед.
20
15
10
в
• ©
1 • •
• в • е
• ^
• 4
•л
ь CK
_|_I_I_I_I_|_
20 30 40 50 60 70 80
Температура, °С
Рис. 2. Зависимость интенсивности люминесценции водного раствора БТШ70 от температуры: 1 — Хвозб = = 260 нм, Хрег = 310 нм, температура увеличивается; 2 (треугольники) — Хвозб = 260 нм, Хрег = 310 нм, температура уменьшается; 3 — Хвозб = 295 нм, Хрег = = 340 нм, температура увеличивается; 4 — Хвозб = = 295 нм, Хрег = 340 нм, температура уменьшается.
квантовым выходом. Квантовый выход трипто-фановой люминесценции БТШ70 составил фп -- 0.03. Следовательно, учитывая положение максимума спектра испускания и низкий квантовый выход, можно заключить, что оба триптофановых люминофора находятся в низкополярном окружении внутри белковой глобулы.
Спектры испускания водного раствора БТШ70 после нагревания до 80°С и последующего охлаждения до комнатной температуры также приведены на рис. 1 (кривые 6, 7). Видно, что наблюдаются существенные отличия от соответствующих спектров нативной формы белка. При возбуждении на длине волны 260 нм (кривая 6) заметно перераспределение интенсивности люминесценции тирозина и триптофана в пользу последнего и длинноволновый сдвиг триптофа-новой полосы от 333 до 340 нм при возбуждении на 295 нм (кривая 7). Это свидетельствует об изменении окружения триптофановых люминофоров от гидрофильного до гидрофобного, что и приводит к возрастанию квантового выхода и длинноволновому сдвигу соответствующей полосы испускания.
Зависимости интенсивности люминесценции водного раствора БТШ70 от температуры при различных длинах волн возбуждения и регистрации представлены на рис. 2.
Кривая 1 (возбуждение 260 нм, испускание 310 нм) соответствует уменьшению интенсивности люминесценции тирозина при повышении температуры. В данном случае имеет место температурное тушение, связанное с увеличением безызлучательной дезактивации возбужденного
состояния. Кривая 3 (возбуждение 295 нм, испускание 340 нм) отражает зависимость изменения интенсивности люминесценции триптофановых люминофоров от температуры при нагревании. Видно, что в интервале 42—57°С интенсивность длинноволновой люминесценции начинает возрастать, что, вероятнее всего, связано с изменением конформации молекулы белка. Далее, выше 57° С снова наблюдается уменьшение квантового выхода. Кривые 2 и 4 соответствуют изменению интенсивности люминесценции тирозина и триптофана соответственно при уменьшении температуры от 76° С до комнатной. Видно, что для тирозина (кривые 1 и 3) зависимости хорошо совпадают во всем интервале температур, тогда как для триптофана (кривые 2 и 4) совпадение наблюдается от 76 до 57°С. Это свидетельствует о необратимости произошедших структурных изменений макр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.