НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 2, с. 123-130
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.822.3
СПОСОБЫ АКТИВАЦИИ И РОЛЬ КАЛЬМОДУЛИНКИНАЗЫ II В РЕГУЛЯЦИИ СЕКРЕЦИИ АЦЕТИЛХОЛИНА
В МОТОРНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ © 2015 г. Е. О. Тарасова, А. Е. Гайдуков*, О. П. Балезина
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
кафедра физиологии человека и животных
В электрофизиологических исследованиях нервно-мышечных синапсов мыши показано, что вызванный выброс медиатора, запускаемый входом кальция по Р/Р-типу кальциевых каналов терми-налей, сохраняется неизменным в присутствии блокатора кальмодулинкиназы второго типа (СаМК11) КМ-62. Растормаживание кальциевых каналов Ь-типа путем блокады фосфатазы кальци-нейрина с помощью циклоспорина А (С8Л) вызывает увеличение квантового состава потенциалов концевой пластинки (КС ПКП), которое может быть предотвращено как блокатором кальциевых каналов Ь-типа нитрендипином, так и предварительной блокадой СаМКП с помощью КЫ-62. Таким образом, только при растормаживании Ь-типа кальциевых каналов происходит усиление секреции ацетилхолина (АХ) с участием активированной СаМКП. При другом способе растормажива-ния кальциевых каналов Ь-типа, путем подавления работы кальций-активируемых калиевых каналов ВК-типа паксиллином, также наблюдали прирост КС ПКП, который блокировался ингибитором СаМК11. Сделано заключение, что в моторных синапсах мыши вход кальция по Р^-типу кальциевых каналов не способен обеспечить избирательную активацию СаМК11, направленную на облегчение передачи. В то же время, при любом способе растормаживания активности кальциевых каналов Ь-типа происходит активация СаМК11, что сопровождается стойким увеличением вызванного выброса медиатора АХ.
Ключевые слова: кальмодулинкиназа второго типа, кальцинейрин, вызванная секреция медиатора, квантовый состав, кальциевые каналы Ь-типа.
Б01: 10.7868/81027813315020090
ВВЕДЕНИЕ
Кальмодулинкиназа II типа (СаМКП) — се-рин-треониновая протеинкиназа, состоящая из 12 субъединиц, формирующих два плотно контактирующих гексамерных кольца. Активация этой киназы происходит с участием кальмодули-на и кальция, с последующим перекрестным аутофосфорилированием ее субъединиц по Т286. После перехода в фосфорилированное состояние активность СаМКП становится независимой от кальция и кальмодулина и направлена на различные внутриклеточные мишени [1]. Хорошо известна роль СаМКП в регуляции пре- и постси-наптической пластичности синапсов. В зависимости от типа синапса и локализации СаМКП в пре- или постсинаптической области, для активации фермента могут служить ионы кальция, поступающие внутрь клетки как по каналам ММПЛ-рецепторов, так и по потенциал-зависимым каль-
*Адресат для корреспонденции: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, тел.: (495) 939-27-92, e-mail: gaydukov@gmail.com.
циевым каналам или через рианодиновые рецепторы кальциевого депо [2—4]. В периферических нервно-мышечных синапсах млекопитающих вопрос о способах активации и роли пресинаптиче-ской СаМКП остается малоизученным. Основным источником поступления кальция в терми-наль моторных синапсов мыши являются кальциевые каналы Р/Р-типа, чья работа обеспечивает кальций-зависимый выброс медиатора при одиночной и ритмической активности синапсов [5]. На моторных нервных окончаниях имеются и кальциевые каналы Ь-типа [6], которые в обычных условиях находятся в заторможенном состоянии, но, будучи расторможенными, существенно усиливают секрецию АХ [7, 8]. Какие кальциевые каналы и какие опосредованные ими кальциевые сигналы могут вызывать избирательную активацию СаМКП и последующее участие фермента в регуляции выброса медиатора АХ, остается не изученным. В связи с этим, целью данной работы было исследовать вызванный выброс медиатора АХ в условиях функционирования потенциалзависимых кальциевых каналов
P/Q-типа, либо L-типа при их растормаживании разными способами. Стояла задача выявить возможные взаимодействия между работой кальциевых каналов, избирательной активацией СаМК11 и ее участием в регуляции выброса медиатора.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование вызванной и спонтанной секреции ацетилхолина (АХ) в зрелых моторных синапсах самцов мышей (P30) (линия 129/Sv) проводили на изолированных "рассеченных" нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы (m. diaphragma — n. phrenicus) при 20—25°C [7]. Мыши умерщвлялись посредством быстрого обезглавливания. Животные содержались в соответствии с директивой 86/609/EEC по обращению человека с лабораторными животными, протокол был одобрен комиссией по биоэтике биологического факультета МГУ. Препарат помещали в камеру объемом 3 мл и перфузировали оксигенирован-ным (95%-ным O2, 5%-ным CO2) раствором Лайли для теплокровных животных (pH 7.2—7.4), содержащим (мМ): NaCl - 135, KCl - 4, NaH2PO4 - 0.9, CaCl2 - 2, MgCl2 - 1, NaHCO3 - 16.3, глюкоза - 11. Одновременную регистрацию миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) и вызванных потенциалов концевой пластинки (ПКП) осуществляли внутриклеточно с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных 2.5 М KCl (сопротивление кончика 10-15 МОм). При изучении ритмической активности стимулировали диафрагмальный нерв короткими пачками сверхпороговых импульсов (50 стимулов с частотой 50 Гц). Сигналы регистрировали при помощи усилителя Axoclamp-2B (Molecular Devices, США) и записывали их на жесткий диск компьютера с помощью аналого-цифрового преобразователя "L-Card Е-154" с интерфейсом "PowerGraph". Полученные данные обрабатывали в программе "MiniAnalysis" (Synaptosoft, США). В каждой серии экспериментов использовали не менее трех нервно-мышечных препаратов. В контроле регистрировали одновременно миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и вызванные ПКП в не менее чем пяти разных синапсах. Далее в перфузирующий раствор добавляли исследуемые вещества в определенном порядке и проводили регистрацию синаптической активности от разных синапсов в течение 60-90 мин. Помимо определения средних значений амплитуд МПКП и ПКП, проводили оценку квантового состава ПКП (КС ПКП), который рассчитывали как отношение средней корректированной на нелинейную суммацию амплитуды ПКП к средней амплитуде МПКП [9]. Достоверность различий между выборками оценивали по ¿-критерию Стьюдента и критерию Манна-Уитни. Уровень значимости отличий между двумя выборками со-
ставлял 0.05 (n — количество исследованных синапсов). В работе были использованы следующие вещества: ингибитор кальцинейрина — циклоспорин А (CsA); ингибитор кальмодулинкиназы второго типа — KN-62 (эфир 4-[(28)-2-[(5-изохи-нолинилсульфонил) метиламино] -3-оксо-3-(4-фенил-1-пиперазинил) пропил] фенилизохино-лин сульфоновой кислоты); блокатор L-типа кальциевых каналов — нитрендипин (этилмети-ловый эфир 1,4-дигидро-2,6-диметил-4-(3-нит-рофенил) - 3, 5 -пиридиндикарбоновой кислоты); ингибитор кальций-активируемых калиевых каналов BK-типа — паксиллин. Все реактивы — Enzo Life Sciences, США.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Известно, что в норме при ритмической активности нервно-мышечных синапсов экзоцитоз медиатора обеспечивается в основном входом кальция по каналам P/Q-типа и при этом наблюдается характерная форма залпа ПКП [5]. В данных экспериментах аппликация блокатора каль-модулинкиназы второго типа KN-62 (3 мкМ) не вызывала достоверных изменений мембранного потенциала мышечных волокон, амплитуды МПКП (0.98 ± 0.05 мВ (n = 16) в контроле и 1.04 ± ± 0.05 мВ (n = 16,p > 0.05) на фоне KN-62), а также квантового состава всех ПКП по ходу залпа по сравнению с контролем (для первого ПКП в залпе: 35.32 ± 1.44 (n = 16) в контроле и 36.19 ± 1.62 (n = 16) при действии KN-62). Это означает, что кальций, входящий по потенциалзависимым кальциевым каналам P/Q-типа и запускающий выброс медиатора, не вызывает активацию СаМЮ! и ее последующее вовлечение в регуляцию вызванного выброса медиатора.
В следующей серии экспериментов проводили растормаживание кальциевых каналов L-типа, находящихся в составе терминалей в неактивном состоянии. Ранее в нашей работе было показано, что блокада базальной активности кальций-каль-модулин-зависимой фосфатазы кальцинейрина с помощью циклоспорина А приводит к расторма-живанию активности L-типа кальциевых каналов и усилению вызванного выброса медиатора [10]. Поэтому в данной работе мы проводили аппликацию CsA в перфузирующий раствор для того, чтобы выяснить, может ли наблюдаемое облегчение секреции АХ быть связано не только с появлением дополнительного источника кальция в терми-нали, но и с активацией СаМЮ!.
Под действием CsA (1 мкМ) достоверно увеличивался квантовый состав первого ПКП в залпе от 30.62 ± 2.53 (n = 11) в контроле до 39.24 ± 2.30 (n = 15, p < 0.05), причем аналогичный прирост сохранялся на протяжении всего залпа (рис. 1). При последующем действии блокатора L-типа кальциевых каналов нитрендипина (1 мкМ)
$
45 -
5 40
35 -
<ч
св Н О
о о
30
л <ч о н Я
я 25
20
15
мВ 1.5 г
15 22 29
Номер ПКП в залпе
36
43
50
Рис. 1. Изменение квантового состава ПКП по ходу короткого ритмического залпа (50 Гц): в контроле (•); на фоне 1 мкМ С8Д (•); при действии нитрендипина (1 мкМ) на фоне С8Д (О). На врезке показаны значения амплитуды МПКП. * р < 0.05 по сравнению с контролем.
1
8
квантовый состав каждого ПКП в залпе возвращался к контрольному уровню и составил у первого ПКП 30.48 ± 2.29 (п = 14, р > 0.05 по сравнению с контролем). На протяжении всего эксперимента не менялся ни мембранный потенциал мышечных волокон (43.55 ± 1.44 мВ (п = 11) в контроле, 44.67 ± 1.71 мВ (п = 15) на фоне С8Л и 44.36 ± 1.68 мВ (п = 14, р > 0.05) на фоне С8Л и нитрендипина), ни амплитуда МПКП (рис. 1). Таким образом, в случае блокады кальцинейрина происходит значительное облегчение вызванного выброса АХ за счет подключения входа кальция по Ь-типу каналов, наряду с функционирующим пулом кальциевых каналов Р/Р-типа.
Для выявления того, активируется ли СаМКП в случае растормаживания кальциевых каналов Ь-типа за счет ингибирования кальцинейрина, и участвует ли она в наблюдаемом облегчении вызванного выброса АХ в этих условиях, мы исследовали залпо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.