ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ, 2004, том 97, № 3, с. 364-369
^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ
УДК 535.37
ТЕМНОПОЛЬНЫЙ МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ СЕЧЕНИЙ ПОГЛОЩЕНИЯ ОДИНОЧНЫХ МОЛЕКУЛ
© 2004 г. Г. М. Свищев
Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН, 119991 Москва, Россия Поступила в редакцию 14.11.2003 г.
Предложен метод измерения сечений поглощения одиночных молекул с помощью темнопольного конфокального микроскопа по интенсивности резонансного релеевского рассеяния света. На примере полимера с сопряженными связями показано, что метод применим и при комнатных температурах для исследования многохромофорных молекул. Метод позволяет распространить спектроскопию одиночных молекул на слабо флуоресцирующие молекулы, исследовать распределения молекул по величине квантового выхода флуоресценции и по механизмам фотодеструкции, получать данные о природе прерывистой флуоресценции многохромофорных объектов.
ВВЕДЕНИЕ
Спектроскопия одиночных молекул (СОМ) предоставляет возможность исследовать статистические распределения молекул по величине различных фотофизических параметров, оценивать степень корреляции этих параметров между собой и наблюдать процессы изменения этих параметров во времени у одной молекулы. Это существенно дополняет данные обычных методов, которые позволяют получать только значения параметров, усредненные по ансамблю и по времени.
При криогенных температурах объектом исследования в СОМ являются только твердые тела (как аморфные, так и кристаллические). В этих условиях однородная ширина бесфононных линий (БФЛ) в 0-0-полосе примесного поглощения приближается к естественной. Поэтому положение и ширина БФЛ оказываются чувствительными датчиками внешних и внутренних полей, действующих на исследуемую молекулу. Это дает возможность получать ценную информацию о примесных молекулах, об их взаимодействиях с молекулами ближайшего окружения и о структуре матрицы (обзоры [1, 2]).
При комнатных температурах объектами СОМ являются не только твердые тела, но и жидкие растворы. Объем доступной спектральной информации об одиночных молекулах в этом случае ограничен из-за большой ширины полос поглощения и люминесценции. Однако интерес к таким исследованиям весьма значителен, потому что они позволяют изучать процессы, которые не идут при криогенных температурах или в твердом теле. В частности, появляется возможность исследовать поведение биологически важных молекул в условиях, свойственных живым организмам [2, 3].
Практически все методы СОМ основаны на прямом измерении только одного фотофизического параметра одиночной молекулы - интенсивности ее флуоресценции. Остальную информацию получают путем изучения зависимости интенсивности флуоресценции от условий измерения - от длины волны, поляризации и интенсивности возбуждающего излучения, от температуры, напряженности внешних полей, времени, от состава и свойств среды и так далее.
Дополнительную информацию об индивидуальных молекулах могло бы дать измерение их сечения поглощения. Во-первых, это позволило бы распространить методы СОМ на слабо флуоресцирующие молекулы. Во-вторых, совместное измерение флуоресценции и поглощения позволило бы изучать пространственные и временные распределения молекул ансамбля по их квантовому выходу флуоресценции, а также корреляции этого параметра с другими фотофизическими свойствами молекул.
Такие измерения могли бы пролить свет и на природу прерывистой флуоресценции, обнаруженной при комнатной температуре у некоторых синтетических и биологических многохромофорных молекул: полимеров, белков, антенных комплексов, дендримеров (см., например, [4] и ссылки в [5]). Предполагается, что в таких молекулах электронное возбуждение мигрирует от поглощающих свет хромофоров на хромофор, который обладает нижайшим локальным уровнем и поэтому служит излучающим центром всей молекулы. Прерывание флуоресценции объясняют фотохимическим изменением этого центра - превращением его в эффективный тушитель флуоресценции. Флуоресценция возобновляется, когда тушитель претерпевает дальнейшее фотохимическое изменение и выходит из резонанса с
соседними хромофорами [6]. При таком механизме прерывистой флуоресценции не должно происходить флуктуаций сечения поглощения молекулы. Существует и другое объяснение наблюдаемых явлений [5], предполагающее, что у такой молекулы есть единое триплетное состояние, после перехода в которое эта молекула перестает поглощать свет на прежней частоте. Тогда сечение поглощения должно изменяться синхронно с интенсивностью флуоресценции.
Сообщалось о разработке методов СОМ для абсорбционных измерений при криогенных температурах [7-9]. Приемлемые результаты были получены только для молекулы террилена в особых условиях (в кристаллах при 2 К), когда сечение поглощения превышает 2 х 10-10 см2. Однако использование этих методов при комнатных температурах невозможно, так как из-за уширения спектральных полос сечение поглощения становится у молекул слишком малым, обычно оно не превышает 10-16 см2 на один хромофор [10]. Ниже описан метод, преодолевающий это затруднение.
МЕТОД
Метод основан на измерении сечения поглощения ^ не по величине пропускания, а по интенсивности света, резонансно рассеянного одиночной молекулой. Для одиночной молекулы такое резонансное релеевское рассеяние света зарегистрировано в [9]. В молекулярной теории этого явления [11] каждая молекула рассматривается как классический демпфированный гармонический осциллятор, раскачиваемый классическим электромагнитным полем. Тогда поляризуемость молекулы является комплексной величиной и испускаемую осциллятором световую волну можно разложить на две составляющие. Одна из них (дисперсионная) обусловлена действительной частью поляризуемости и сдвинута по фазе относительно волны накачки на п/2. Поэтому она влияет только на фазу результирующей волны, но не на ее амплитуду. Вторая составляющая (абсорбционная) обусловлена мнимой частью поляризуемости и в волновой зоне распространяется в проти-вофазе с волной накачки. Именно в результате интерференции этой составляющей с падающей волной и происходит ослабление падающего пучка. Таким образом, поглощение света можно регистрировать не только по ослаблению падающего на молекулу пучка, но и в стороне от этого пучка - по интенсивности резонансно рассеянного света.
При такой регистрации поглощения фон, обусловленный падающим излучением, снижается на несколько порядков и значительно возрастает отношение сигнала к фону 5БЯ (подобно тому, как это происходит при регистрации флуорес-
Я А Ь1 Б Ь2 ^ Ь3 РН Б
Рис. 1. Устройство для измерения сечений поглощения одиночных молекул темнопольным методом: ¿1 и ¿2 - микрообъективы, ¿3 - линза, 5 - объект, Я - фазовая пластинка, А - ослабитель, Я - антифлуоресцентный светофильтр, РН - точечное отверстие в диафрагме, й - фотодетектор.
ценции под углом к возбуждающему пучку). Имеется и другая возможность увеличения 5БЯ, связанная с тем, что сигнал когерентен с возбуждающим излучением. Смешивание на фотоприемнике сигнала с когерентным ему опорным пучком (так называемая гетеродинная регистрация) дает существенное увеличение 5БЯ при правильном выборе мощности опорного пучка. Использование этого приема в конфокальной микроскопии обсуждается, например, в [12].
Устройство, предлагаемое для экспериментальной реализации описанного метода измерения сечений поглощения одиночных молекул, представляет собой вариант конфокального микроскопа проходящего света (рис. 1). Квазимонохроматический пучок параллельных лучей с частотой ю фокусируется объективом Ь1 с числовой апертурой ЫА1 в некоторую точку О внутри тонкого образца 5. Перед центральной зоной объектива Ь1 установлены круглый ослабитель света А, который имеет на частоте ю очень низкое пропускание Т (порядка 10-7-10-6), и фазовая пластинка Я, которая доводит общий сдвиг фазы, вносимый пластинками А и Я, до величины пт, где т - целое число. Предполагается, что в микроскопе обеспечена возможность периодического увеличения и уменьшения т на единицу (путем механической смены Я или электрооптически). Ослабитель А делит падающее на объектив Ь1 излучение на два осесимметричных пучка - примыкающий к оптической оси микроскопа опорный пучок Бт{ с мощностью потока Яге(- и возбуждающий пучок Бех с мощностью потока Яех, имеющий форму полого конуса, охватывающего пучок БгеГ.
Величина числовой апертуры объектива Ь2 (МА2 < ^А1) должна исключать попадание в этот объектив возбуждающего излучения. Объективы ¿2 и Ь3 проектируют точку О через антифлуоресцентный светофильтр Я в точку О' (в центр круглого "точечного" отверстия РН). Свет, прошедший через это отверстие, регистрируется фо-
тодетектором D. Если объективы L1 и L2 рассчитаны на применение покровных стекол и иммерсионной жидкости, то образец должен быть заключен между такими стеклами, а зазор между ними и объективами должен быть заполнен такой жидкостью.
Задача светофильтра F - по возможности задержать свет флуоресценции исследуемых молекул и как можно полнее пропустить на фотодетектор свет с частотой ю. Это может быть голо-графический светофильтр с полосой пропускания на частоте ю. При спектральных измерениях положение полосы пропускания светофильтра должно меняться синхронно с ю. В этом случае светофильтр может быть заменен диспергирующим элементом (призмой или решеткой), который в сочетании с точечным источником (молекулой) в точке O и точечным отверстием PH способен функционировать как монохроматор. Для того чтобы регистрировать от одной и той же молекулы одновременно и рассеяние света, и люминесценцию, часть света, прошедшего через объектив L2, можно отклонить каким-либо способом в канал регистрации флуоресценции, аналогичный описанному выше каналу регистрации рассеянного света (но со светофильтром, задерживающим свет с частотой ю и пропускающим люминесцентное излучение).
СОСТАВ ИЗЛУЧЕНИЯ НА ВЫХОДЕ МИКРОСКОПА
Предлагаемый метод применим для измерений сечения поглощения одиночной молекулы как при комнатных, так и при криогенных температурах. Ниже будут рассмотрены измерения только при комнатных температурах (как наиболее сложные). Из-за большего се
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.