НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 1, с. 52-63
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 615.835.14:[612.181.5+612.828+612.825]
ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ХОЛИНЕРГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ В МЕХАНИЗМАХ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ: МНОГООБРАЗИЕ ПУТЕЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ РЕОРГАНИЗАЦИИ in vivo © 2013 г. Е. И. Захарова*, Э. Л. Германова, Р. А. Копаладзе, А. М. Дудченко
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии
и патофизиологии" Российской академии медицинских наук
Изучали влияние одноразового сеанса умеренной гипобарической гипоксии (ГБГ, 10% О2, 60 мин) на центральные холинергические системы. С этой целью определяли активность биомаркера холи-нергических нейронов холинацетилтрансферазы (ХАТ) и содержание белка в субфракциях синап-тических мембран и синаптоплазмы, изолированных из "легких" и "тяжелых" синаптосом каудаль-ных стволовых структур мозга крысы (варолиев мост и продолговатый мозг, "понтомедулла"), не-окортекса и гиппокампа. Исследования проводили на интактных крысах, а также низкоустойчивых и высокоустойчивых к гипоксии, предварительно однократно перенесших тяжелую гипобариче-скую гипоксию (4% О2). Выявлено, что на ГБГ синаптический пул понтомедуллы отреагировал во всех группах крыс, неокортекса — в группах интактных и высокоустойчивых крыс, а гиппокампа — ни в одной из них. ГБГ вызвала разнообразную реакцию цитозольных и мембраносвязанных ХАТ и белков, индивидуально проявившуюся в исследованных группах крыс. Представлен обзор о роли цитозольной и мембраносвязанной ХАТ в регуляции обмена и секреции ацетилхолина in vitro. Обосновывается, что in vivo срочная адаптация (1) в интактном мозге идет по пути трансформации холинергического синаптического пула с формированием и активацией контактов устойчивого к гипоксии морфологического типа; (2) в мозге низко- и высокоустойчивых крыс — по пути торможения холинергической активности в разных популяциях синапсов и редукции нехолинергической популяции, предположительно ГАМКергической. Исследование демонстрирует (1) многообразие пластических возможностей мозга, а также (2) один из естественных механизмов гипоксического прекондиционирования интактного мозга — формирование и активацию в понтомедулле и неокор-тексе морфологических типов холинергических синапсов, устойчивых к гипоксии.
Ключевые слова: прекондиционирование, умеренная гипобарическая гипоксия, интактные крысы, крысы с низкой и высокой устойчивостью к гипоксии, понтомедулла, неокортекс, гиппокамп, холинергические системы, субфракции синаптическихмембран и синаптоплазмы, мембраносвязанная и цитозольнаяхо-линацетилтрансфераза.
DOI: 10.7868/S102781331301010X
ВВЕДЕНИЕ
Среди немедикоментозных оздоровительных воздействий на организм все более широко практикуются методы гипокситерапии, использующие гипоксический тренинг в терапевтических и профилактических целях [1—6]. Это определило актуальность изучения механизмов прекондициони-рования, в том числе их центральных звеньев, в разных режимах гипоксических тренировок.
* Адресат для корреспонденции: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8; тел. 8(919)966-86-57; факс 8(495)601-23-66; e-mail: zakharova-ei@yandex.ru.
Принятые сокращения: ГБГ — одноразовая умеренная гипобарическая гипоксия; понтомедулла — продолговатый мозга и варолиев мост ствола мозга; м — мембраносвязан-ный; с — цитозольный (синапто плазматический); ХАТ — холинацетилтрансфераза; АХЭ — ацетилхолинэстераза; NVP — 4-(1-нафтил)пиридин.
В широком смысле прекондиционирование — это короткие эпизоды любых умеренных стрессор-ных воздействий, способных активировать эндогенные защитные механизмы организма. В условиях умеренной гипоксии (8—11% О2), в которой протекают все гипокситренировки, ключевая роль в адаптивных преобразованиях организма принадлежит автономным дыхательной и сердечно-сосудистой системам, центральное представительство которых локализовано в продолговатом мозге. Автономные системы функционально тесно взаимосвязаны между собой "дыхательным центром" — системой дыхательных нейронов продолговатого мозга, обеспечивающих автогенерацию дыхательного ритма [7, 8]. В обеих системах выявлено холи-нергическое звено на всех уровнях автономной регуляции - от рецепторных клеток [9—11] и сенсор-
ных входов в продолговатый мозг [12, 13] до парасимпатических эфферентов из продолговатого мозга [14—16] и рецепторов мышечных клеток, осуществляющих моторные рефлексы на крупных сосудах и дыхательных путях [16—19].
Центральные холинергические эффекты в ответ на рецепторную стимуляцию наблюдались как в симпатических, так и в парасимпатических реакциях дыхательного центра [20—25], включая прямую модуляцию функции дыхательных нейронов [26, 27]. Однако в силу сложной, сетчатой организации дыхательного центра и такой "вездесущности" центральных холинергических влияний остается еще много неясного в том, какую реальную роль они играют in vivo в условиях физиологической нормы. Еще менее этот вопрос изучен в механизмах гипоксического прекондиционирования. Это касается холинергических систем как продолговатого мозга, так и вышестоящих структур, с которыми дыхательный центр находится в теснейшем взаимодействии [7, 8].
Среди экспериментальных моделей наиболее выраженный, хотя и кратковременный преконди-ционирующий эффект, с пиком в первые минуты последействия, показала одноразовая безинтер-вальная тренировка в режиме гипобарической гипоксии (ГБГ) [28]. Поэтому в настоящей работе на модели ГБГ исследовалась роль холинергических систем задних структур ствола мозга, неокортекса и гиппокампа в механизмах прекондиционирова-ния в группах интактных крыс, а также низко- и высокоустойчивых к гипоксии. В субфракциях си-наптических мембран и синаптоплазмы "легких" и "тяжелых" синаптосом, изолированных из трех структур мозга, оценивалось влияние ГБГ на активность фермента синтеза ацетилхолина холина-цетилтрансферазы (ХАТ, EC 2.3.1.6), биомаркера холинергических нейронов, и содержание белка. По нашим данным, дифференцированное исследование мембраносвязанной и водорастворимой ХАТ позволяет выявлять дополнительную информацию о функционально-метаболическом состоянии функционально различных холинергических синаптических популяций [29—32].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работу проводили на белых беспородных крысах-самцах весом 300—400 г из одной партии. Часть крыс предварительно тестировали на их устойчивость к острой гипобарической гипоксии в барокамере на критической высоте (11.5 тыс. м, эквивалентно 4% О2) и ранжировали на низкоустойчивых и высокоустойчивых к гипоксии (переживающих до появления агональных вдохов, соответственно, меньше 3-х и больше 10-ти мин) [33]. Через 3 недели после тестирования низко- и высокоустойчивые, а также интактные крысы подвергались одно-
кратному безинтервальному сеансу ГБГ в барокамере на высоте 5 тыс. м (эквивалентно 10% О2, 60 мин). Через 4 мин после окончания тренировки крыс декапитировали с помощью гильотины (n = = 6/5/3 для интактных/низко-/высокоустойчивых крыс). Контролем служили интактные, низко- и высокоустойчивые крысы, не подвергавшиеся ГБГ. В контрольных группах n = 4/7 для интакт-ных/низко- и высокоустойчивых крыс за исключением субфракции синаптоплазмы во фракции тяжелых синаптосом понтомедуллы у низкоустойчивых крыс, для которой n = 3.
Синаптические фракции выделяли из неокор-текса, гиппокампа и каудальных структур ствола мозга, варолиева моста и продолговатого мозга (понтомедулла). Соответственно, понтомедулла включала всю область под 4-м желудочком мозга. Это обеспечивало включение целиком "парасимпатического церебровазодилятаторного центра", самой ростральной зоны холинергической иннервации сосудов мозга, расположенной в ростральной части продолговатого мозга и каудальной части ва-ролиева моста [34], а также анатомическую идентичность препарированных стволовых структур.
Используя прерывистые градиенты плотности сахарозы, из всех структур мозга изолировали фракции "легких" и "тяжелых" синаптосом, а из фракций синаптосом после процедур разрушения их целостности — субфракции синаптических мембран и синаптоплазмы, как описано ранее [32]. Активность ХАТ определяли радиометрически по методу F. Fonnum [35] в модификации [32, 36], содержание белка — спектрометрически по методу Лоури [37]. Соответственно, в субфракциях синап-тических мембран измеряли мембраносвязанные (м) синаптические показатели (активность мХАТ и содержание м-белков), а в субфракциях синаптоплазмы — водорастворимые (активность сХАТ и содержание с-белков). Поскольку определялась максимальная активность м- и сХАТ, то оценивались тем самым изменения каталитической активности фермента.
Результаты биохимического исследования выражали в соответствующих единицах активности фермента или содержания белка на 1 г сырого веса ткани и обрабатывали статистически по непараметрическому критерию Точного Метода Фишера. Также проводился корреляционный анализ исследованных с- и м-показателей с целью отличить функциональные, метаболические изменения от количественных изменений пресинасов, как структурных единиц. Корреляцию оценивали по r-критерию Пирсона, используя компьютерную программу Microsoft Excel и корректирующую формулу для малых выборок [38]. С учетом поправки Бонферрони, достоверными в обоих методах считали уровень значимости p < 0.025 и, в отдельных случаях, p < 0.02 (при сравнении больше
%
150 100
50 -
0
%
150 г
100
50 -
ХАТ БЕЛОК
ХАТ БЕЛОК
ГИППОКАМП D
0 ХАТ
%
150 _ С **
ХАТ БЕЛОК
ПОНТОМЕДУЛЛА D
**
100
50 -
ХАТ БЕЛОК
ХАТ БЕЛОК
Рис. 1. Влияние однократного сеанса ГБГ на активность ХАТ и содержание белка в субсинаптических фракциях неокортекса, гиппокампа и понтомедуллы интактных крыс.
Понтомедулла — продолговатый мозг и варолиев мост. В каждом ряду столбиков: С — субфракции легких си-наптосом, D — субфракции тяжелых синаптосом (по классификации De Robeгtis Е. и др. [103]). В каждой паре столбиков: левый (темный) — субфрация синап-тических мембран, правый (светлый) — субфракция синаптоплазмы. Данные выражены в процентах по отношению к значениям в контрольной группе, принятым за 100%. Обозначения достов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.