НЕИРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 4, с. 328-332
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.8-005:615.03:577.334:577.15
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ БИГУАНИДОВ НА ОКСИДАТИВНЫЙ СТАТУС ТКАНЕЙ КРЫС ПРИ ИШЕМИИ/РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
© 2009 г. О. А. Сафонова1' *, Т. Н. Попова1, А. В. Макеева1, Л. Ф. Панченко2
воронежский государственный университет, Воронеж 2НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
Проведено исследование влияния некоторых синтетических производных бигуанида на интенсивность свободнорадикальных процессов и активность каталазы в тканях крыс при ишемии/реперфузии головного мозга. Показано, что при введении фенилэтилбигуанида и 2,4-диметоксифенилбигуанида на фоне данной патологии в головном мозге происходит уменьшение соотношения лактат/пируват, являющегося показателем степени нарушения клеточного метаболизма по сравнению со значениями при патологии. При этом в головном мозге и сыворотке крови крыс наблюдается снижение параметров биохемилюми-несценции, отражающих интенсивность свободнорадикальных процессов, возрастающую в условиях ишемии/реперфузии. Выявлено также уменьшение степени мобилизации антиоксидантной системы в тканях крыс по сравнению с данными параметрами при патологии. Полученные данные свидетельствуют о возможности проявления исследуемыми производными бигуанида антиоксидантных и протекторных свойств в условиях ишемического повреждения ткани, сопровождаемого развитием оксидативного стресса.
Ключевые слова: бигуаниды, ишемия/реперфузия головного мозга, крысы, свободнорадикалъное окисление, биохемилюминесценция, каталаза.
Принятые сокращения: СРО - свободнорадикальное окисление, АОС - антиоксидантная система, АФК - активные формы кислорода, ИРГМ - ишемия/реперфузия головного мозга, ПОЛ - перок-сидное окисление липидов.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что интенсификация свободноради-кального окисления (СРО) является неспецифическим звеном патогенеза многих заболеваний, в том числе и ишемических повреждений головного мозга [1]. В этих условиях важную адаптивную роль играет активация антиоксидантной системы (АОС) организма, значительное место в которой отведено каталазе, поскольку именно этот фермент нейтрализует Н2О2, способный давать начало самому ре-акционноспособному свободному радикалу - ОН*. Однако внутренних резервов АОС организма не всегда достаточно для борьбы с чрезмерным образованием активных форм кислорода (АФК) при патологии, что делает актуальным исследование возможностей применения антиоксидантных соединений в технологии разработки новых лекарственных препаратов, способных оказывать позитивный эффект при усилении СРО. В этом плане большой интерес представляют производные гуанидина, обладающие широким спектром биологической активности. Так, некоторые из них проявляют анти-оксидантную активность, обусловленную торможе-
* Адресат для корреспонденции: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1; тел.: 8(4732)208-278; e-mail: solga@bio.vsu.ru
нием клеточных окислительных реакций, в том числе и окислительного гликозилирования белков [2, 3]. Имеются данные, что гуанидиновые производные, например, меркаптоэтилгуанидин, мет-формин и другие, способны непосредственно перехватывать свободные радикалы или опосредованно уменьшать их содержание за счет торможения внутриклеточного формирования [4, 5].
В связи с вышесказанным цель настоящей работы - исследование влияния фенилэтилбигуанида и 2,4-диметоксифенилбигуанида на интенсивность СРО и активность каталазы в тканях крыс при ишемии/реперфузии головного мозга (ИРГМ). Выбор данных веществ в качестве протекторов был осуществлен с помощью компьютерного прогнозирования биологической активности с использованием программы PASS, доступной в режиме on-line по адресу http://www.ibmh.msk.su/pass.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили самцы белых крыс массой 150-200 г. Индуцирование ишемии головного мозга у животных опытных групп осуществляли путем 30-минутной окклюзии общих сонных артерий [6]. Реперфузии достигали снятием
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ БИГУАНИДОВ НА ОКСИДАТИВНЫЙ СТАТУС 329
Влияние бигуаиидов иа содержание лактата и пирувата при постишемической реперфузии головного мозга крыс
Группа животных Содержание лактата, мкмоль/г Содержание пирувата, мкмоль/г Соотношение лактат/пируват
Контроль 1.76 ± 0.07 0.170 ± 0.0068 10.35 ± 0.42
ИРГМ 5.84 ± 0.23* 0.071 ± 0.0029* 82.25 ± 3.29*
ИРГМ + фенилэтилбигуанид 4.22 ± 0.20*' ** 0.102 ± 0.0047*' ** 41.37 ± 1.93*, **
ИРГМ + 2,4-диметоксифенилбигуанид 3.98 ± 0.17*' ** 0.111 ± 0.0052*' ** 35.81 ± 1.64*, **
* Отличия от контроля достоверны (уровень значимостир < 0.05); ** отличия от значений при ИРГМ достоверны (уровень значимостир < 0.05).
окклюзоров. Визуально контролировали восстановление кровотока. Спустя 3 сут животных забивали. Кровь забирали из сердца, головной мозг извлекали из черепной коробки по стандартной методике.
Производные гуанидина - фенилэтилбигуанид и 2,4-диметоксифенилбигуанид - были синтезированы на кафедре органической химии химического факультета Воронежского государственного университета. Данные бигуаниды вводили внутрибрю-шинно в виде раствора в 1 мл 0.9% №С1 в дозе 50 мг/кг веса животного дважды в сутки в течение трех дней. Первое введение используемых бигуани-дов осуществляли через 15 мин после восстановления кровотока.
Экспериментальные животные были разделены на 4 группы: 1-ю группу (контроль; п = 8) составляли ложнооперированные животные; 2-ю группу (п = 8) составляли животные с ИРГМ; в 3-й группе (п = 7) животным после восстановления кровотока вводили фенилэтилбигуанид; в 4-й группе (п = 8) животным после восстановления кровотока вводили 2,4-диметоксифенилбигуанид.
Гомогенаты для биохимических анализов готовили из целого мозга крыс. Для этого навеску головного мозга гомогенизировали в 3-кратном объеме охлажденной среды выделения (50 мМ трис-НС1-буфер (рН 7.8), содержащий 1 мМ ЭДТА, 1% Р-меркаптоэтанол) и центрифугировали при 5000g в течение 10 мин. Содержание пирувата в гомогена-те головного мозга определяли по реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой, при 340 нм [7]. Для определения содержания лактата использовали диагностический набор фирмы "Витал", принцип метода которого заключается в образовании из лактата окрашенного комплекса с ^шах 505 нм под действием лактатоксидазы и пероксидазы. Интенсивность СРО и общую антиоксидантную активность оценивали методом Ре2+-индуцированной биохемилюминесценции на БХЛ-07 в течение 30 с при температуре 25°С в среде следующего состава: 0.4 мл 0.1 М калий-фосфатного буфера (рН 7.5), 0.4 мл 0.01 мМ Бе804, 0.1 мл исследуемого материала, 0.2 мл 2% Н2О2. После внесения пробы с последующим перемешиванием осуществляли регистра-
цию следующих параметров: светосумма (S) и интенсивность максимальной вспышки (Imax), отражающих интенсивность свободнорадикальных процессов [8], тангенс угла падения кинетической кривой (tg а2), определяемый по углу наклона касательной к участку падения кинетической кривой и характеризующий скорость снижения интенсивности свечения и, следовательно, общую антиоксидантную активность биопробы. Активность каталазы определяли по методу, основанному на взаимодействии Н202 с молибдатом аммония, приводящему к образованию окрашенного комплекса с максимумом поглощения при 410 нм [9]. За ферментативную единицу (Е) принимали количество фермента, необходимого для превращения 1 мкмоля субстрата в 1 мин при 25°С. Аналитические определения для каждой пробы проводили в 2-кратной по-вторности. Результаты опытов сравнивали с контролем. Для статистической обработки использовали стандартные методы [10]. Оценку достоверности различий проводили по i-критерию Стьюдента. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0.05. В таблице и на рис. 1, 2 приводятся средние арифметические значения исследуемых параметров и их стандартные ошибки.
В работе были использованы следующие материалы и реактивы: трис ("Sigma", США), НАДН ("Sigma", США), препарат лактатдегидрогеназы ("Sigma", США), остальные реактивы - отечественного производства марки "х.ч." или "ч.д.а.".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как известно, в патогенезе повреждения головного мозга ишемического характера особо важную роль играют нарушения энергетического обмена и интенсификация СРО [1, 6]. Установлено, что окклюзия обеих общих сонных артерий с последующей реперфузией приводит к глубоким изменениям в метаболизме головного мозга крыс. Так, нами было выявлено увеличение содержания лактата в
3.3 раза на фоне снижения содержания пирувата в
2.4 раза в головном мозге крыс по сравнению с контрольными значениями (таблица). Отношение лак-
70
и
и ц
н
е ц
с е К о
¡>40 юм
л и м
е
*
о и
ю со
60 50
30 20 10
+
А
шкш
+-
и16 ц
н
е
" 12 е н и м
й8 и м
е
х 4 о и
ю ! 0
и
и6 ц
н
е ц
с
е
н4 и4
м
ю л и
м2 е2
*
о и
ю
2
л л
1 2 3 4 1 2 3 4
Группы животных
А
ГI ~1 1 !
1 2 3 4 1 2 3 4
Группы животных
А
■
- 1 2 3 4 1 2 3 4
Группы животных
Рис. 1. Параметры биохемилюминесценции головного мозга (А) и сыворотки крови (Б) крыс экспериментальных групп: 1 - контроль, 2 - ИРГМ, 3 - введение фенилэтилбигуанида на фоне ИРГМ, 4 - введение 2,4-диме-токсифенилбигуанида на фоне ИРГМ. Обсуждаются статистически достоверные различия прир < 0.05.
тат/пируват, являющееся показателем интенсивности анаэробного или гликолитического пути превращения углеводов, возрастало в 8 раз, что свидетельствует о подавлении аэробного и усилении "аварийного" гликолитического механизма образования энергии. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что перевязка сонных артерий у крыс приводит к выраженному снижению интенсивности кровотока в больших полушариях и нарушению оксигенации мозга [11].
При введении фенилэтилбигуанида и 2,4-диметоксифенилбигуанида животным с ИРГМ в гомоге-нате мозга было отмечено возрастание уровня пи-
рувата в 1.4 и 1.6 раза и снижение уровня лактата в 1.4 и 1.5 раза соответственно по сравнению со значениями при патологии. Отношение лактат/пиру-ват снижалось при этом в 2.0 и 2.3 раза, что может свидетельствовать о наличии у исследуемы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.