НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 3, с. 218-223
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.822
ВЛИЯНИЕ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ УМЕРЕННОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЕЙ НА ЭКСПРЕССИЮ Мп-СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В ГИППОКАМПЕ КРЫС
© 2007 г. С. А. Строев1' 2, Е. И. Тшлькова1, И. А. Тугой3, Т. С. Глущенко1, М. О. Самойлов1*, М. Пелто-Хьшкко2
1 Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия 2 Медицинская школа Университета г. Тампере, Финляндия 3 Кафедра компьютерных наук, Университет г. Тампере, Финляндия
Молекулярные механизмы, обеспечивающие нейропротекцию при гипоксическом воздействии, включают индукцию антиоксидантов, в том числе Mn-СОД. Ранее нами было показано, что содержание Mn-СОД в нейронах гиппокампа несколько повышается к 3 часам после тяжелой гипобари-ческой гипоксии (ТГ). Предварительное прекондиционирование тремя сеансами умеренной гипоба-рической гипоксии (ГП) существенно усиливало экспрессию Mn-СОД в областях CA2 и CA3 гиппокампа, но не в CA1 и DG по сравнению с непрекондиционированными животными. Оставалось неясным, с чем связано повышение содержания Mn-СОД у прекондиционированных крыс: с индукцией экспрессии Mn-СОД умеренными воздействиями еще до ТГ или с модификацией реакции на саму ТГ. Для решения этого вопроса нами было проведено иммуноцитохимическое исследование собственного влияния ГП на экспрессию Mn-СОД в гиппокампе крыс.
Показано, что к 24 ч после трех сеансов ГП (то есть к началу действия ТГ) иммунореактивность к Mn-СОД была повышена в CA1 и DG, но не в CA2 и CA3. Таким образом, эффект прекондициони-рования на экспрессию Mn-СОД после ТГ проявляется в тех областях гиппокампа, в которых ГП-воздействие само по себе не вызывает увеличения экспрессии этого белка. Следовательно, нейро-протективный эффект прекондиционирования на ранних сроках после ТГ связан не с накоплением в ходе прекондиционирования Mn-СОД, а с модификацией самой реакции на тяжелую гипоксию.
Ключевые слова: Mn-СОД, гиппокамп, умеренная гипоксия, прекондиционирование.
Принятые сокращения: Mn-СОД - Mn-зависимая супероксиддисмутаза.
ВВЕДЕНИЕ
Гиперпродукция свободных радикалов - важнейший фактор повреждения нейронов мозга, вызываемых гипоксией и последующей реоксиге-нацией [1-3]. Супероксиддисмутазы (СОД), катализирующие дисмутацию супероксидного аниона
(О-) [4], снижают уровень клеточного повреждения, вызванного свободнорадикальными процессами [5-8].
Известны различные формы СОД. Си, Zn-СОД присутствует в цитозоле и ядре клеток практически всех типов [9, 10], Мп^ОЬ локализована преимущественно в матриксе митохондрий [1113], экстраклеточная СОД присутствует в лимфе и плазме крови [14-16]. Кроме того, известны железосодержащая СОД, обнаруженная у некоторых прокариот и растений [17], и никель-со-
* Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; e-mail: samoilov@pavlov.infran.ru
держащая СОД у некоторых видов бактерий
[18], однако они пока не найдены у животных. Поскольку митохондрии являются основным источником свободных радикалов и играют ключевую роль в запуске программы клеточной гибели
[19], митохондриальная Мп-СОД играет существенную роль в защите от окислительного стресса, в том числе вызванного гипоксическими/ише-мическими воздействиями [6, 20, 21].
В используемой нами экспериментальной модели острая тяжелая гипобарическая гипоксия (ТГ) вызывает массовую гибель нейронов в гиппокампе и новой коре, однако предварительное прекондиционирование трехкратной умеренной гипобарической гипоксией (ГП) существенно снижает уровень повреждения в мозге [22-24], уменьшает смертность животных в ходе эксперимента [22, 23], предотвращает развитие нарушений памяти и поведения [23, 25, 26]. Молекулярные механизмы нейропротекции у прекондиционированных животных включают, по-видимому,
модуляцию экспрессии ранних генов и их белковых продуктов [22, 23, 27], изменение соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Bcl [24, 28], модификацию активности семейства митогенактивируемых протеинкиназ [29], повышение содержания антиоксидантных белков [3034] и соответствующих им мРНК [35].
В частности, нами было показано, что прекон-диционирование существенно повышало экспрессию Mn-СОД в областях CA2 и CA3 гиппокампа после ТГ по сравнению с непрекондиционирован-ными животными [34]. Оставалось, однако, неясным, с чем связано это повышение: с индукцией экспрессии Mn-СОД умеренными воздействиями еще до ТГ или с модификацией реакции на саму ТГ у прекондиционированных животных. Для решения этого вопроса нами проведено исследование характера экспрессии Mn-СОД в гиппокампе крыс непосредственно после сеансов прекондици-онирования, то есть через 3 и 24 часа после предъявления 3-кратной умеренной гипобариче-ской гипоксии.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили на двух группах (по 6 животных в каждой) взрослых крыс-самцов линии Вистар весом 200-250 г. Первая группа подвергалась трехкратному воздействию умеренной гипобарической гипоксии в барокамере проточного типа при давлении 360 мм рт. ст. (что соответствует подъему на высоту 5000 м) по 2 ч 1 раз в сутки. Вторую группу составляли контрольные животные, которых также помещали в барокамеру трехкратно, по 2 ч в сутки, но при нормальном давлении. Уровень экспрессии Mn-СОД определяли иммуноцитохимическим методом в структурах гиппокампа через 3 и 24 ч после последнего сеанса.
Для проведения иммуноцитохимического анализа анестезированных животных перфузиро-вали транскардиально сначала 100 мл физиологического раствора, затем в течение 4-5 мин -4%-ным раствором параформальдегида в 0.1 M фосфатном буфере (PBS; pH 7.3). После окончания перфузии животных декапитировали, мозг извлекали и в течение 60 мин фиксировали тем же фиксатором. До начала анализа образцы мозга хранили в 15%-ном растворе сахарозы в фосфатном буфере PBS при температуре +4°С.
Ткань замораживали в Tissue-Tek® O.C.T™ Compound (Sakura Finetek) и немедленно с помощью криоката при температуре -20°C делали фронтальные срезы мозга толщиной 11 мкм на уровне гиппокампа и базолатеральной миндалины (примерно -2.80 мм от линии bregma [36]). Срезы помещали на предметные стекла, покрытые поли-Ь-лизином (Sigma), и в течение 15 мин пре-инкубировали в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, Boehringer Mannheim GmbH). Затем в течение ночи инкубировали с
первичными поликлональными аффинно-очи-щенными кроличьими антителами к Mn-СОД человека (StressGen Biotechnologies Corp, разведение 1:2000 в фосфатном буфере PBS, содержащем 1% BSA и 0.3% Triton X-100) при +4°С. Затем после трехкратной промывки в фосфатном буфере (по 15 мин каждая) срезы инкубировали с биотинили-рованными козьими вторичными антителами (Vector Labs, разведение 1:300) в течение 30 мин при комнатной температуре. После повторной трехкратной промывки в фосфатном буфере срезы в течение 30 мин инкубировали с авидин-биотиновым комплексом (Vector Labs) при комнатной температуре. Для визуализации иммунной реакции и выявления локализации Mn-СОД использовали диаминобензидин. Срезы обезвоживали проводкой в спиртовых растворах возрастающей концентрации, а затем в ксилоле и заключали в бальзам Entellan.
Количественный анализ иммунореактивности нейронов проводили с использованием системы, состоящей из микроскопа (Nikon Microphot-FXA), камеры (PCO Computer Optics GmbH) и компьютера IBM PC с программами Image-Pro Plus (Media Cybernetics) и Morphix [37].
Уровень экспрессии Mn-СОД определяли в нейронах Аммонова рога (области СА1, СА2 и СА3) и зубчатой извилины (DG) гиппокампа. Анализ изображений проводили на участке длиной 500 мкм. Уровень иммунореактивности нейронов исследуемых образований оценивали в 6 срезах от каждого мозга. Интенсивность окрашивания на цифровых изображениях выражали в условных единицах оптической плотности от 0 (абсолютно белого) до 100 (абсолютно черного). Иммунореактивные клетки подразделяли на два условных класса: слабо окрашенные (окраска на 1-10 усл. ед. интенсивнее фона) и интенсивно окрашенные (более чем на 10 условных единиц интенсивнее фона). Уровень иммунореактивности оценивался по двум критериям: общему числу иммунореактивных клеток, выраженному в процентах от контроля (N+), и числу интенсивно окрашенных клеток, также выраженному в процентах от контроля (Ni). Статистическую обработку данных проводили посредством однофак-торного дисперсионного анализа (ANOVA).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммуноцитохимический анализ показал, что трехкратная умеренная гипобарическая гипоксия в режиме прекондиционирующего воздействия изменяет уровень экспрессии Mn-СОД в гиппокампе крыс (рис. 1-3).
В CA1 к 3 ч после воздействия в два раза повышалось общее число экспрессирующих Mn-СОД клеток (N+ = 200) (рис. 1, 2). При этом отмечалось незначительное (статистически недостоверное) снижение числа интенсивно экспрессирующих
A :_:
шштш
Б
iv-stfr j ^ en Л;«. ТЗйкЪг/ -fR
V ш & » 'If м
в
Рис. 1. Иммунореактивность к Mn-СОД в области CA1 гиппокампа. Микрофотографии области CA1 гиппокампа в контроле (A), через 3 (Б) и 24 (В) ч после трехкратной умеренной (прекондиционирующей) гипобарической гипоксии. Масштаб - 50 цт.
данный белок клеток (Ni = 80) (рис. 3). К 24 ч N+ несколько снижалось, но по-прежнему оставалось достоверно выше контрольного уровня (N+ = 149), а Ni существенно повышалось как по сравнению с 3-часовым сроком, так и с контролем (Ni = 169) (рис. 1-3).
Иммунореактивность в CA2 и CA3 в оба срока статистически не отличалась от контроля, хотя можно отметить тенденцию к снижению в этих областях Ni к 3 ч и его восстановление до контрольного уровня к 24 ч (рис. 1-3).
В DG достоверное повышение Ni обнаруживалось только к 24 часам после воздействия (Ni = = 199), увеличение общего числа экспрессирующих Mn-СОД клеток было при этом недостоверным (N+ = 116) (рис. 1-3).
Таким образом, достоверное повышение экспрессии Mn-СОД к 24 ч после трехкратной умеренной гипобарической гипоксии отмечалось в областях гиппокампа CA1 и DG, в то время как в CA2 и CA3 статистически значимых изменений уровня экспрессии не наблюдалось.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Известно, что повыше
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.