научная статья по теме АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ Биология

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ»

RESULTS OF IMMUNOGENETIC TYPING IN CHILDREN AND ADULTS EXPOSED TO MAN-MADE HAPTENS

Dolgikh O. V.123, Bubnova O. A.12, Gorshkova K. G.1, Pirogova E. A.12

'FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies", 2Perm State National Research University, 3Perm State National Research Polytechnical University, Perm

A comparative evaluation of immunogenetic typing of gene polymorphism in children exposed to man-made pollutants, with genotypes of their parents, has been carried out. An excess prevalence of variant alleles of detoxification genes CYP1A1, CPOX, SULT1A1, and variable allelilism of immunocompetent genes (TNFalfa) and genes characterizing the state of the vascular endothelial (VEGF and eNOS) in children and their parents has been revealed. The data presented suggest securing negative immunogenetic information of parents in children exposed to man-made haptens.

Key words: gene polymorphism, genetic associations, detoxification genes

АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ

У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ

Долгушин И. И., Маркова В. А., Квятковская С. В., Никушкина К. В., Смирнова Т. Г., Самусева И. В., Колбина Е. В., Логинова Ю. В.,

Батурина И. Л.

НИИ иммунологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, Челябинск, Россия

Нейтрофильные гранулоциты основные клетки врожденной иммунной системы. Их основная функция - уничтожение патогенных микроорганизмов и предотвращение их распространения в организме. В работе дана оценка фагоцитарной и кислородзависимой активности нейтрофилов периферической крови у здоровых доноров. Показано, что функциональная активность нейтрофилов не зависит от пола донора.

Ключевые слова: нейтрофилы, фагоцитоз, кислородзависимый метаболизм, проточная цитофлюориметрия

Актуальность. Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Их количество в периферической крови поддерживается на постоянном уровне благодаря притоку из костного мозга [5]. Это профессиональные охотники за микробами, обладающие самой высокой подвижностью среди всех клеток организма человека [3]. Изучение строения, физиологии нейтрофильных гранулоцитов, биохимического состава их гранул, структуры

синтезируемых ими метаболитов и роли этих клеток в регуляции иммунного гомео-стаза является одной из актуальных проблем иммунологии [2].

В основе защитной функции нейтрофиль-ных гранулоцитов лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности распознавать, поглощать, убивать и переваривать микробные клетки [1]. Среди бактерицидного арсенала нейтрофила кислородзависимые механизмы можно отнести к числу наиболее эф-

306

Иммунорегуляция

фективных. Поступающий в клетку кислород почти не используется при генерации энергии, а расходуется на образование бактерицидных метаболитов [3].

Целью работы являлось определение функциональной активности нейтрофильных гра-нулоцитов периферической крови у здоровых мужчин и женщин методом проточной ци-тофлюориметрии.

Методы. Для достижения поставленной цели за период с 2012 по 2013 год на базе НИИ иммунологии ЮУГМУ было проведено обследование 30 практически здоровых мужчин и 30 практически здоровых небеременных женщин в первую и вторую фазы менструального цикла, чей возраст варьировался от 18 до 35 года.

Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов методом проточной цитоф-люориметрии цельную гепаринизирован-ную венозную кровь смешивали со взвесью ФИТЦ-меченой культурой 5. аигеи. Пробы инкубировали при температуре 37°С в течение 30 минут [1]. По окончании инкубации проводили лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов.

Для определения внутриклеточного кисло-родзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови методом проточной ци-тофлюориметрии использовали изначально нефлюоресцирующий краситель дихлороф-люоресцеина диацетат (ДХФ-ДА). ДХФ-ДА пассивно проникая внутрь клетки, обрабатывается эстеразами и становится полярным соединением, неспособным диффундировать обратно из клетки. Краситель, после реакции с перекисью водорода, образующейся во время «кислородного взрыва», превращался во флюоресцирующее соединение (область зеленого спектра), что позволило анализировать клет-

ки по интенсивности свечения красителя с помощью проточной цитометрии. Для индукции кислородного «взрыва», оцениваемого с помощью этого метода, использовали классический стимулятор - форбол-миристат-ацетат, активатор протеинкиназы С [4]. Для постановки реакции цельную гепаринизированную периферическую венозную кровь смешивали с рабочего раствора ДХФ-ДА (10цМ) и инкубировали при температуре +37°С в течение 30 минут. Пробы инкубировали при температуре 37°C в течение 30 минут. По окончании инкубации проводили лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов.

Анализ образцов проводили на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (BeckamCoulter, США). По показателям прямого и бокового светорассеивания в окне Dot Plot гейтировалась популяция нейтрофилов. В гистограмме FL1 отражалась интенсивность флюоресценции нейтрофилов в зеленой области спектра, а в соответствующем им окне статистики отражались показатели среднегеометрической интенсивности свечения меченых клеток (Х Mean). Количество собираемых событий по нейтрофилам было не менее 3000.

Полученные результаты исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica for Windows (v. 8.0). Полученные данные обработали общепринятыми методами вариационной статистики и представили в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m), n - количество наблюдений в выборке. О достоверности межгрупповых различий судили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Проверка статистических гипотез осуществляли при критическом уровне значимости р < 0,05.

Группа Спонтанная реакция Индуцированная реакция Индекс стимуляции нейтрофилов, у.е.

Активность,% Интенсивность, у. е. Активность,% Интенсивность, у. е.

Женщины первая фаза м.ц., п=30 26,57±3,21 23,82±1,66 76,47±3,72 42,65±4,60 3,59±0,55

Женщины вторая фаза м.ц., п=30 26,89±3,49 17,74±1,24 86,79±2,03 34,96±1,19 3,84±0,46

Мужчины, п=30 28,54±3,57 20,70±1,72 77,75±3,34 39,68±3,29 3,32±0,47

Таблица. Определение кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови здоровых доноров методом проточной цитофлюориметрии (М ± т)

Результаты. В ходе выполнения работы было установлено, что показатели кислород-зависимого метаболизма нейтрофильных гра-нулоцитов периферической крови не зависят от пола обследуемых лиц и также оставались неизменными у женщин на протяжении всего менструального цикла. У здоровых лиц 28% нейтрофилов крови в неактивированном состоянии генерировали активные формы кислорода в системе НАДФН-оксидазы, что выражалось в флюоресценции клеток в зеленой области спектра, а после активации нейтрофилов ФМА количество данных клеток возрастало до 86%. Индекс стимуляции нейтрофильных гранулоцитов в среднем имел значение 3,5 (табл.).

Анализ оценка фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлюори-метрии основана на применении в качестве объекта фагоцитоза S. aureus, конъюгирован-ных с флюоресцеин изотиоцианатом, показал, что 93% нейтрофилов активно захватывали St. aureus. Различий в показателях активности и интенсивности фагоцитоза у доноров разного пола выявлено не было.

Таким образом, из приведенного исследования можно сделать вывод, что показатели функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови не зависят от пола обследуемых лиц и остаются постоянными у женщин на протяжении всего менструального цикла. Использование для оценки функциональной активности ней-трофильных гранулоцитов метод проточной цитофлюориметрии является эффективным и возможно применение в практических.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Долгушин И. И., Андреева Ю. С., Савочкина А. Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Изд-во РАМН, 2009, 208 с.

2. Пинегин Б. В., Маянский А. Н. Иммунология 2007, 28, 6, 374-382.

3. Шмагель К. В., Черешнев В. А. Клетки врожденного иммунитета. Пермь, 2011, 241 с.

4. Model M. A., Kukuruga M. A. J. of Immunol. Meth. 1997,202, 105-111.

5. Nathan C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 173-182.

ANALYSIS THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF PERIPHERAL BLOOD NEUTROPHILS BY FLOW CYTOMETRY IN HEALTHY DONORS

Dolgushin I. I., Markova V. A., Kvyatkovskaya S. V., Nikushkina K. V., Smirnova T. G., Samuseva I. V., Kolbina E. V., Loginova J. V., Batyrina I. L.

The Institute of Immunology South Ural State Medical University of the Ministry of Health of Russia,

Chelyabinsk, Russia

Neutrophil granulocytes are the main cells of the innate immune system. Their main function - the destruction of pathogens and preventing their spread in the body. In work given the evaluation of phagocytic and oxygen-dependent activity of peripheral blood neutrophils from healthy donors. It was shown that the functional activity of neutrophils is not dependent on the donor sex.

Key words: neutrophils, phagocytosis, oxygen-dependent metabolism, flow cytometry

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»