научная статья по теме ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНАЦИИ Биология

Текст научной статьи на тему «ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНАЦИИ»

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ВАКЦИНАЦИИ

Храмцов П. В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Сконструирована полуколичественная неинструментальная дот-иммуноаналитическая система для персонифицированного мониторинга иммунитета к возбудителям инфекционных заболеваний на основе функционализированных G белком стрептококка углеродных наночастиц. Она позволяет установить титр антител к коклюшу, дифтерии и столбняку в единовременной постановке в течение 2-х часов. При помощи разработанной системы была произведена оценка коллективного противококлюшного иммунитета у детей г. Пермь. Продемонстрирован низкий уровень серопротекции (23%) в группе детей (п=43) возрастом от 6 мес. до 12 лет. Чувствительность диагностической системы в 4 раза выше, чем у реакции агглютинации с коклюшным микробом. Оперативность, простота, прибо-ронезависимость, возможность визуального определения результатов анализа определяют перспективность разработанного теста для использования в качестве инструментальной основы персонального подхода к оценке эффективности вакцинации.

Ключевые слова: напряженность иммунитета, дот-иммуноанализ, функционализиро-ванные наночастицы, углеродные наночастицы, вакцинация

Для оценки эффективности вакцинации в масштабе популяции в настоящее время используют три основных показателя: охват населения профилактическими прививками, уровень заболеваемости и серомониторинг. С нашей точки зрения существует ряд причин для внедрения в практику персонифицированного подхода к оценке напряженности иммунитета к инфекциям, управляемым методами вакцинопрофилактики.

Одной из таких причин является несовершенство современной методологии контроля вакцинации. Рассмотрим мониторинг эффективности вакцин против коклюша, дифтерии и столбняка. Охват профилактическими прививками против этих заболеваний в течение последних лет находится на уровне >97%. Заболеваемость столбняком является спорадической, такая же ситуация была в последние годы характерна и для дифтерии, однако специалисты утверждают о «возвращении» этой инфекции [1, 2]. Заболеваемость коклюшем держится на достаточно высоком уровне (5/100 тыс.), а у детей грудного возраста достигает в некоторых регионах 100 больных на 100 тыс. и выше. Кроме того, имеются основания

заявлять о значительном занижении уровня заболеваемости коклюшем, что связано с низкой эффективностью его диагностики [3].

Существуют определенные недостатки и в подходе к оценке коллективного иммунитета к инфекционным заболеваниям [4, 5]. Если говорить конкретно о дифтерии, столбняке и коклюше, наибольшие вопросы вызывает возрастной состав индикаторных групп при оценке противококлюшного иммунитета, точнее индикаторной является единственная группа - дети 3-4 лет. Литературные данные свидетельствуют о том, что эта группа является наиболее благополучной с точки зрения напряженности иммунитета, а снижение уровня серопротекции и рост числа серонегативных лиц наблюдается у более взрослых детей [3, 6]. Территориальное распределение индикаторных групп также вызывает вопросы - наибольшее внимание уделяется крупным городам [7], в то время как удаленные районы игнорируются, а именно в этих районах наиболее высока вероятность проблем с доставкой вакцинных препаратов и соблюдением «холодовой цепи». Подробные данные об им-муноструктуре населения в регионах доступ-

ны лишь из результатов нерегулярных научных исследований [3, 8, 9, 10].

Ни в коей мере при проведении серомо-ниторинга и формировании календаря прививок не учитывается влияние степени загрязненности окружающей среды на уровень поствакцинального иммунитета. Исследования, проводившиеся в Пермском крае, Иркутской и Читинской областях, свидетельствуют о снижении результативности вакцинации в районах с повышенным уровнем загрязнения, особенно в отношении коклюша [11, 12].

Важной тенденцией последних лет является снижение доверия населения к вакцино-профилактике. Это связано с недостаточным уровнем понимания большинством людей принципов и механизмов действия вакцин, а также активизацией антивакцинаторского движения [2, 13]. Ключевую роль при этом играет, на наш взгляд, недостаточная прозрачность процесса вакцинации и его результатов, отсутствие инструмента, который позволял бы оценить эффективность конкретной вакцины при введении ее конкретному человеку.

Наиболее продуктивным в такой ситуации является персонифицированный подход к мониторингу эффективности профилактики. Его суть состоит в определении титра антител для каждого пациента. Персонифицированный подход позволит учитывать влияние таких факторов, как индивидуальные особенности организма пациента, уровень техногенного загрязнения, позволит выявлять партии вакцины, не оказывающие должного эффекта вследствие неправильной транспортировки или хранения. Кроме того, он предоставит обширную информацию, важную для понимания формирования иммунитета на различных территориях и в различных климато-экологических условиях. Предпосылкой для внедрения такого подхода является активная разработка в последние годы целого ряда методов упрощенной диагностики, предназначенных для повсеместного массового использования, независимых от обеспеченности приборами и уровня квалификации персонала [14, 15].

Целью настоящей работы являлась разработка неинструментальной комплексной диагностической системы на основе функ-ционализированных углеродных наночастиц, предназначенной для персонифицированной оценки напряженности иммунитета к коклю-

шу, дифтерии и столбняку в варианте единовременного тестирования.

Материал. 43 образца сывороток венозной крови детей в возрасте от полугода до 12 лет были получены из ГДКП № 5, г. Пермь. Все дети были вакцинированы цельноклеточны-ми отечественными вакцинами: АКДС или БУБО согласно Национальному календарю прививок. В качестве отрицательного контроля использовали образцы сывороток крови не вакцинированных детей, у которых не было выявлено противококлюшных антител в реакции агглютинации.

Растворы и реагенты для иммуноанали-за: 0,15 М NaCl, забуференный 0,015 М Na-фосфатами, рН 7,25 (ЗФР); ЗФР, содержащий 0,1% твина-20 (ЗФРТ). Все использованные растворы приготовлены на деионизирован-ной воде.

Нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм «Bio-Rad» (США), бычий сывороточный альбумин (БСА), IgG человека, G белок стрептококка «Sigma» (США), твин-20 «Panreac» (Испания), дифтерийный и столбнячный анатоксины, инактивированная суспензия коклюшных микробов вакцинных штаммов «Микроген» (Россия), диагностикум коклюшный для реакции агглютинации «Эко-лаб» (Россия).

Методы.

Синтез углеродного диагностикума.

Диагностикум на основе ковалентно функ-ционализированных G белком стрептококка углеродных наночастиц был синтезирован по оригинальной двухэтапной технологии [16].

Диагностический реагент сохраняет свои структурно-функциональные свойства на протяжении 20 лет (срок наблюдения) при хранении в температурных условиях 2-8 °C [17].

Проведение дот-иммуноанализа. Восемь полосок нитроцеллюлозной мембраны размером 0,6х1,3 см закрепляли на пластиковой основе в виде гребенки, как показано на рис.

На полоски сорбировали по 0,6 мкл антигенов в виде точек в порядке, указанном на рис. Сенсибилизирующие концентрации антигенов составили: столбнячный и дифтерийный анатоксины - 0,1 мг/мл, суспензия коклюшных клеток 10 Международных оптических единиц (МОЕ). В качестве положительного контроля на каждую полоску сорбировали IgG человека в концентрации 0,1 мг/мл. Все анти-лиганды были разведены до конечных концен-

Рис. Устройство гребенки для дот-иммуноанализа Кружками схематично обозначены зоны сорбции анти-лигандов: КС - суспензия коклюшных микробов в концентрации 10 МОЕ, ДА - дифтерийный анатоксин 0,1 мг/ мл, СА - столбнячный анатоксин 0,1 мг/мл, - человека 0,1 мг/мл (положительный контроль)

траций в ЗФР. Каждая гребенка предназначена для анализа одного образца сыворотки крови в 8-ми серийных разведениях.

После нанесения анти-лигандов и высыхания полосок гребенки помещали в 6 мл блока-тора: ЗФРТ, этот же буфер использовался для промывки гребенок и разведения образцов сывороток крови и диагностикума. Блокирование и последующие промывки гребенок производили на качающемся шейкере таким образом, чтобы жидкость омывала целиком поверхность каждой нитроцеллюлозной полоски. Длительность блокирования составляла 60 мин. Затем гребенки погружали полоски гребенок в лунки полистирольного 96-луноч-ного планшета, содержащие по 300 мкл анализируемых образцов сывороток крови. Для анализа использовали сыворотку, в серийных разведения кратных двум, начиная с 1/10. Длительность инкубации гребенок в сыворотке составляла 30 мин.

После получасовой промывки полоски погружали в лунки полистирольного планшета, содержащие по 300 мкл углеродного диагно-стикума. Спустя 15 минут гребенки извлекали из лунок и промывали в течение 5 мин. Титр тестируемых сывороток крови определяли по последней визуализируемой точке в ряду серийных разведений.

В качестве референсной системы определения титра антител к коклюшу использовали реакцию агглютинации.

Результаты и обсуждение. Была сконструирована система для индивидуального определения в сыворотке крови титров антител к дифтерийному, столбнячному токсинам,

а также возбудителю коклюша. Чувствительность системы в 4 раза превышает таковую у РА, специфичность подтверждена при исследовании сывороток крови невакциниро-ванных детей. Простота постановки анализа, приборонезависимость, оперативность анализа (менее полутора часов), возможность одновременного полуколичественного определения антител к трем компонентам вакцины открывают перспективы для применения ее в клинической практике для персонифицированного контроля эффективности вакцинации, оценки напряженности коллективного иммунитета, выяснения состояния гуморального иммунитета у пациентов с неизвестным прививочным анамнезом и т.д.

Разработанная система диагностики была использована для оценки напряженности иммунитета к коклюшу ср

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»