ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФОРМ АТФ И БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА (БТШ70) ПРИ ИНДУЦИРОВАННОМ АЛЛЕРГИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
Сервули Е. А., Постовская А. М.1, Сапожников А. М., Шевченко М. А.
Институт Биоорганической Химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, отдел иммунологии, лаборатория клеточных взаимодействий; 'Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра иммунологии,
Москва, Рссия
Внеклеточный пул белков семейства БТШ70 обладает уникальными иммуномодулирую-щими свойствами и протективной активностью при воспалительных процессах, в том числе воспалениях, протекающих в дыхательных путях. Повышение концентрации внеклеточного БТШ70 наблюдали при аллергической бронхиальной астме. АТФ-азная и шаперонная активности, характерные для белков семейства БТШ70 дают возможность предположить протективный эффект увеличения уровня внеклеточного БТШ70. В данной работе были прослежены изменения концентраций внеклеточных форм БТШ70 и АТФ при развитии индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей. Показали, что соотношение концентраций внеклеточных БТШ70/АТФ было снижено в острой и эффекторной фазах, но не в отсутствии и не на стадии разрешения воспаления. Относительный недостаток внеклеточного БТШ70 был охарактеризован как одна из причин развития аллергического воспаления дыхательных путей.
Ключевые слова: белок теплового шока 70, АТФ, аллергическое воспаление дыхательных путей
Внеклеточный пул белков семейства БТШ70 обладает уникальными иммуномо-дулирующими свойствами и протективной активностью при воспалительных процессах [1, 2]. Повышение концентрации внеклеточного БТШ70 наблюдали в различных воспалительных процессах, в том числе при аллергической бронхиальной астме [3, 4]. Долгое время БТШ70 относили к так называемым «сигналам опасности», способствующим активации провоспалительного иммунного ответа. Однако полученные в последние годы данные свидетельствуют в пользу того, что повышение концентрации внеклеточного БТШ70 носит протективный характер [5]. Тот факт, что БТШ70 подавляют способность дендритных клеток активировать Т-лимфоциты [6], в том числе и ^2 - клетки, играющие ключевую роль в аллергическом иммунном ответе, позволяет сделать предположение о возможной протективной роли БТШ70 при аллергическом воспале-
нии дыхательных путей. Кроме того, протективный эффект увеличения концентрации БТШ70 наблюдали в дыхательных путях при воспалительных процессах не аллергической природы [7, 8]. АТФ-азная активность, характерная для белков семейства БТШ70 [9] позволяет предположить, что одним из механизмов супрессии воспаления под действием БТШ70 может быть дефосфорили-рование одного из основных медиаторов воспаления - молекулы АТФ, резкое увеличение уровня которых наблюдали в лаваж-ной жидкости после провокации аллергеном у пациентов-астматиков и в мышиных моделях астмы [10]. Аллергическая бронхиальная астма является одной из основных проблем здравоохранения во многих странах [11], поэтому исследования механизмов регуля-торной и защитной активности БТШ70 при астме необходимы как для фундаментальной биологии, так и для экспериментальной и практической медицины.
В данной работе нами была прослежена динамика внеклеточного уровня БТШ70 в процессе развития аллергического воспаления дыхательных путей и проведено сопоставление с динамикой секреции АТФ.
Исследования проводили с использованием стандартной овальбумин (ОУА)-инду-цированной модели аллергического воспаления дыхательных путей. Мыши линии BALB/c подвергались внутрибрюштнным инъекциям OVA/Alum на день 0 и 7 10 мкг/мышь/инъек-цию с последующими интафарингеальными ингаляциями 0,1% раствора OVA. Бронхиальные смывы собирали ежедневно в течение 72 часов после последней ингаляции аллергена. Концентрацию АТФ в лаважной жидкости определяли по изменению люминол-зависимой хемилюминесценции при помощи набора ENLITEN ATP Assay System (Promega, США). Измерение хемилюминесценции проводили при помощи люменометра AutoLumat LB 953 (Berthold Technology, GmbH). Уровень внеклеточного БТШ70 в бронхиальных смывах мышей оценивали и методом ИФА с использованием набора для определения БТШ70 (DuoSet IC, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA) и планшетного ридера Multiskan FC (Thermo Scientific, Германия). Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета функций для статистической обработки программы Prism. В табл. представлены средние значения и стандартные отклонения. Данные подвергались анализу с помощью критерия t-тест Стьюдента. Различие значений при p<0.05 рассматривалось как достоверное.
Как было показано группой Idzko [10], провокация аллергеном приводит к увеличению уровня АТФ. Нами были прослежены изменения уровня внеклеточного АТФ через 24, 48 и 72 часа после последней ингаляции аллерге-
на. Пик секреции АТФ приходился на 24 часа (см. табл.), то есть на острую фазу аллергического воспаления дыхательных путей, характеризующуюся повышением уровня нейтро-филов (до 27±3%), и эозинофилов (до 25±2%) в бронхоальвеолярных смывах. В эффектор-ной фазе и позже (на 72 часа) наблюдалось снижение уровня внеклеточного АТФ (см. табл.), а так же снижение уровня нейтрофилов (до 16±1%). Таким образом, нами было определено, что АТФ является маркером острой фазы аллергического воспаления дыхательных путей.
Повышение концентрации БТШ70 в межклеточном пространстве служит «сигналом опасности» и наблюдается при воспалительных процессах [3]. Однако шаперонная активность БТШ позволяет предположить, что синтез этих белков при стрессе носит про-тективный характер. В данной работе мы проследили динамику концентрации внеклеточного БТШ70 в течение 3 суток после ингаляции аллергена. Как и в случае АТФ, в острой фазе наблюдалось увеличение секреции БТШ70 во внеклеточное пространство. Повышение уровня БТШ70 в лаважной жидкости было замечено и на 48 часов, а относительное снижение наблюдалось лишь на 72 часа после последней ингаляции аллергена (см. табл.).
Сопоставляя значения концентраций внеклеточных АТФ и БТШ70, мы показали, что, несмотря на повышение уровня внеклеточного БТШ70 в дыхательных путях в острой фазе воспаления, соотношение концентрации БТШ70: АТФ было значительно ниже, чем на стадии разрешения воспаления и чем у ин-тактных мышей (см. табл.). Таким образом, относительный недостаток внеклеточного БТШ70 был охарактеризован как одна из причин развития воспаления.
Таблица. Динамика концентраций внеклеточных БТШ70 и АТФ, а так же соотношения концентраций БТШ70: АТФ
Время после ингаляции аллергена, ч Концентрация внеклеточного АТФ, nM Концентрация внеклеточного БТШ70, nM БТШ70: АТФ
0 0,021±0,003 0,018±0,001 0,850±0,129
24 0,205±0,023*** 0,0432±0,008* 0,281±0,0471
48 0,045±0,042 0,103±0,008** 2,281±0,280**
72 0,063±0,047 0,092±0,006 1,466±0,342*
NM 0,018±0,006 0,021±0,003 1,151±0,001**
В табл. приведены значения концентраций внеклеточных форм БТШ70 и АТФ в бронхо-альвеолярных смывах мышей, а так же соотношения этих концентраций. Данные приведены на 24, 48 и 72 часа после последней ингаляции аллергена. Результаты представлены в виде средних значений ± стандартные ошибки среднего по данным как минимум 2 экспериментов: 3 и 5 мышей в группе; достоверное отличие значений от значений, полученных до ингаляции (время 0 ч) р<0.05 обозначено *; р<0.01: **.
Исследования последних лет показали, что АТФ, выходящий во внеклеточное пространство при механическом повреждении, стрессе или гибели клеток, играет важную роль при аллергическом воспалении дыхательных путей [12]. Резкое увеличение уровня АТФ в лаважной жидкости после провокации аллергеном наблюдали у пациентов-астматиков и в мышиных моделях астмы [10]. Было установлено, что при повышении уровня внеклеточного АТФ, происходит активация Р2Х7 рецепторов, которая вызывает рост продукции провоспалительных цитокинов 1Ь-1, 6, 18, ТОТ-а макрофагами, 1Ь-1^, И-18, TNF-а и 1Ь-23 дендритными клетками, 1Ь-8 и эозинофильного катионного белка (ЕСР) эозинофилами, гистамина тучными клетками, а указанные процессы способствуют развитию ^2-опосредованного иммунного ответа [13]. При направленной нейтрализации АТФ в дыхательных путях в мышиной модели астмы приток воспалительных клеток и повреждение ткани бронхов значительно снижались [10].
В нормальных физиологических условиях уровень АТФ во внеклеточном пространстве поддерживается на наномолярном уровне с помощью экзоферментов (Е^ТРБ), относящихся, как и БТШ70, к суперсемейству актин/ БТШ70/гексокиназ, и характеризующихся сходной с БТШ70 конформацией АТФ-связываю-щего центра, регулируемой двухвалентными ионами Са2+ или [14]. Как и БТШ70, Е^ТРБ обладают АТФ-азными свойствами, однако эти молекулы функционируют только на поверхности клеток, но не во внеклеточном прстранстве [15, 16].
До настоящего времени участие БТШ70 в регуляции концентрации внеклеточного пула АТФ напрямую подтверждено не было. Несмотря на это, учитывая наблюдаемое
в данной работе повышение концентрации внеклеточного БТШ70 в очаге воспаления и его АТФ-азную активность, можно предположить, что белки семейства БТШ70 также принимают участие в регуляции уровня АТФ во внеклеточном пространстве, лимитируя активацию P2X7 рецепторов путем снижения уровня активационного сигнала. Очевидно, что описанное выше предполагаемое участие БТШ70 в нейтрализации внеклеточного пула АТФ, способствующего развитию процессов аллергического воспаления, можно также рассматривать как один из молекулярных механизмов противовоспалительных эффектов внеклеточного пула БТШ70.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Srivastava P. Nat Rev Immunol. 2002, 2, (3), 185-94.
2. Stocki P., Dickinson A. M. Autoimmune Dis. 2012, 617213.
3. De Maio A. Cell Stress Chaperones 2011, 16, (3), 235-49.
4. C. Hou; H. Zhao; W. Li; Z. Liang; D. Zhang; L. Liu; W. Tong; S. X. Cai; F. Zou, Cell Stress Chaperones
2011, 16, (6), 663-71.
5. T. J. Borges; L. Wieten; M. J. van Herwijnen; F. Broere; R. van der Zee; C. Bonorino; W. van Eden, Front Immunol 2012, 3, 95.
6. Stocki P., Morris N. J., Preisinger C., Wang
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.