DEFENSINS AS REGULATORS OF THE COMPLEMENT SYSTEM Umnyakova E. S., Berlov M. N., Kokryakov V. N.
'Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of Russian Academy of Medical Sciences;
2Saint-Petersburg State University, St. Petersburg, Russia
Antimicrobial peptides (AMPs) are important molecular factors of innate immune system. In addition to their antimicrobial activity AMPs are known to act as immunomodulators. In this work we investigated the influence of human AMPs (a-defensin HNP-1, ^-defensin HBD-2, and cathelicidin LL-37) on activation of the complement system. We demonstrated that HNP-1 and HBD-2 in concentration 10 micrograms per milliliter can activate complement cascade, while LL-37 has no influence. The complement activity was estimated by E. coli cytoplasmic membrane permeabilization due to membrane attack complex formation. Also we revealed that both investigated human defensins as well as porcine cathelicidin PG-1 can form complexes with human C1q molecule, but LL-37 doesn't interact with this protein. The complexes of AMPs and C1q were stable in 0,5 M NaCl.We can propose that defensins play an important role of physiological endogenous complement regulators. Probably, the regulation occurs as a result of their interaction with C1q.
Key words: antimicrobial peptides, defensins, cathelicidins, the complement system, C1q
ХАРАКТЕРИСТИКА КАТИОННЫХ ФРАКЦИЙ АНТИМИКРОБНЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МОЛОКА
ЧЕЛОВЕКА
Фатеева С. Е., Курдюмова И. В., Леонова Л. Е.
Санкт-Петербургский государственный университет, биологический факультет, кафедра биохимии, Санкт-Петербург, Россия
Биологически активные белки и пептиды различных живых систем и организмов от бактерий до млекопитающих играют существенную роль в выживании в среде патогенных и условно патогенных микроорганизмов и являются чрезвычайно важными компонентами системы врожденного иммунитета. Антимикробные белки и пептиды, как факторы врожденного иммунитета, играют существенную роль и в формировании иммунной системы новорожденных. Биологически активные компоненты молока столь многочисленны и многофункциональны, что их более детальное изучение представляет большое значение в изучении формирования иммунитета новорожденных, что открывает перспективы в создании лекарственных средств, необходимых для профилактики и терапии новорожденных с первых дней жизни. В данном исследовании методом препаративного электрофореза в кислой среде в присутствии мочевины было проведено фракционирование белков и пептидов молока, сыворотки молока и обессоленного экстракта молока человека. В отдельных электрофоретических фракциях были выявлены белковые комплексы, в состав которых входили альфа-дефенсины человека (НЫР1-4), лактоферрин, лактопероксидаза, миелопероксидаза.
Ключевые слова: антимикробные белки и пептиды, врожденный иммунитет, молоко человека
Введение. Биологически активные белки и пептиды различных живых систем и организмов от бактерий до млекопитающих играют существенную роль в выживании в среде патогенных и условно патогенных микроорганизмов и являются чрезвычайно важными ком-
понентами системы врожденного иммунитета. Антимикробные белки и пептиды, как факторы врожденного иммунитета, играют существенную роль и в формировании иммунной системы новорожденных [1]. К настоящему времени не вызывает никакого сомнения огромное зна-
чение молока человека не только в качестве источника необходимых питательных веществ, но и в качестве источника биологически активных факторов, играющих существенную роль в становлении и развитии защитных систем организма, с первых дней жизни новорожденного. Показано, что дети, переведенные на искусственное вскармливание, страдают от инфекций в 4 раза чаще, а от кишечных инфекций в 10 раз чаще, по сравнению с детьми, находящимися на грудном молочном вскармливании [2]. Грудное молоко - уникальный продукт молочных желез, содержащий несколько сотен компонентов, необходимых новорожденному для его нормального роста и развития. Грудное молоко неоднородно и представляет собой эмульсию жировых глобул, казеиновых мицелл и широкого спектра компонентов водной фазы. Водная фаза составляет около 87% всего объема молока, в ней содержатся соли, витамины, микроэлементы, сахара, белки и пептиды, и их комплексы, а также различные биологически активные факторы. К основным биологически активным факторам молока человека относятся иммуноглобулины, различные факторы роста, антимикробные белки и пептиды (лизо-цим, лактоферрин, лактопероксидаза, миело-пероксидаза, альфа-лактальбумин, дефенсины и другие) [3]. Эти компоненты секретируются тканями молочных желез и клетками иммунной системы (нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, фагоциты) [4]. Антимикробные белки и пептиды - это древние и важные компоненты врожденного иммунитета, способные эффективно противостоять патогенным и условно патогенным микроорганизмам [1, 5]. Состав и соотношение компонентов молока изменяется в течение срока лактации и в зависимости от особенностей организма [3]. Биологически активные компоненты молока столь многочисленны и многофункциональны, что их более детальное изучение представляет большое значение в изучении формирования иммунитета новорожденных, что открывает перспективы в создании лекарственных средств, необходимых для профилактики и терапии новорожденных с первых дней жизни [6].
Целью нашего исследования было изучение антимикробных белков и пептидов молока человека и их способности к комплексообразо-ванию с другими белками.
Материал и методы. В работе было использовано молоко добровольных здоровых до-
норов. Сыворотку молока получали центрифугированием при 25000g в течение 30мин. Экстракты молока получали с помощью увеличения ионной силы раствора до 2М хлористого натрия и изменением кислотности раствора до рН 2,5 уксусной кислотой до конечной концентрации 5%. Молоко и сыворотку молока человека анализировали методом аналитического электрофореза в 15,5% ПААГ в кислой среде в присутствии мочевины по методу Панима С. и Чакли Р. [7] и в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия по методу Шеггера Х. [8]. Катионные белки молока и сыворотки молока человека фракционировали методом препаративного электрофореза в кислой буферной системе при непрерывной элюции белков из полиакриламидного геля по методу Харвиг С. [9]. Иммуноблоттинг проводили по методу Тобина Х. и др. [10]. Дот-иммуноферментный анализ проводили по методу Колиган Д. [11]. Антимикробную активность определяли методами радиальной диффузии в агарозном геле [12] и методом наложения геля [13]. Наличие лизоцима определяли методом радиальной диффузии в агорозном геле (субстрат M. lysodeikticus) [14]. Антимикробные фракции подвергали ОФ ВЭЖХ на колонках Supelco Discovery HS C-18 с использованием линейного градиента ацетонитрил-вода 5-60% с противоионом 0,1% ТФУ [15]. Концентрацию белка определяли флуориметрическим методом на приборе Qubit 2.0 стандартным набором Qubit Protein Assay Kit фирмы Invitrogen. Все результаты статистически обработаны и являются достоверными.
Результаты. Препараты молока и сыворотки молока были проанализированы методом аналитического электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия. Во всех препаратах были выявлены 3 группы белков с молекулярной массой 14-15кДа, около 20-25кДа, более 55кДа. Методом аналитического электрофореза в кислой среде в присутствии мочевины показано, что наиболее подвижная катионная фракция содержит белки с молекулярной массой около 14кДа, содержит лизоцим, и обладает высокой антимикробной активностью против грамположительных (L. monocytogenes) и грамотрицательных (E.coli) бактерий. Менее подвижная катионная фракция обладает слабой антимикробной активностью против тех же штаммов бактерий, имеет молекулярную массу около 14кДа и содержит
альфа-лактальбумин. Методом иммуноблотин-га было показано, что в этой фракции также присутсвуют дефенсины (ЫЫР-1-3). Наименее подвижная катионная фракция содержала как высокомолекулярные антимикробные белки (лактоферрин и миелопероксидаза), так и низкомолекулярные антимикробные пептиды (дефенсины ЫЫР-1-4) с высокой электрофо-ретической подвижностью. По результатам дот-иммуноферментного анализа сыворотка молока человека содержала в несколько раз меньше антимикробных белков и пептидов по сравнению с молоком. Методом препаративного электрофореза были получены отдельные катионные фракции молока, сыворотки молока и обессо-леного экстракта молока человека. Наиболее подвижная катионная фракция молока содержала лизоцим и обладала высокой антимикробной активностью, менее подвижная содержала дефенсины ЫЫР-1-4 и альфа-лактальбумин, кроме того дефенсины, лактоферрин, миело-пероксидаза и лактопероксидаза были выявлены во фракциях с наименьшей подвижностью. Стоит отметить, что наибольшей антимикробной активностью обладала высокоподвижная катионная фракция, менее подвижная обладала слабой антимикробной активностью, а низкоподвижные катионные фракции обладали незначительной антимикробной активностью или не имели антимикробной активности. Возможно, антимикробные белки и пептиды образуют высокомолекулярные комплексы с меньшей антимикробной активностью, которые даже не разрушаются в условиях проведения препаративного электрофореза (5% уксусная кислота и 3М мочевина). Сходные результаты были получены при фракционировании сыворотки молока человека, хотя содержание антимикробных белков и пептидов в полученных фракциях было значительно ниже по сравнению с отдельными катионными фракциями цельного молока. Мы предприняли попытку экстрагировать катионные белки и пептиды, связанные с казеиновой фракцией, для разрушения высокомолекулярных белковых комплексов увеличением ионной силы до 2М ЫаС1 и понижением рН уксусной кислотой до 2,5. Полученный экстракт обессоливали методом ультрафильтрации. После обессоливания часть экстрагированных белков сыворотки выпала в осадок, который отделили центрифугированием при 14000g. Затем полученный экстракт был подвергнут препаративному электрофоре-
зу в кислой среде в присутствии мочевины. Метод
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.