РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), №. 1 с.
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА С-590Т И в-1098Т В ГЕНЕ ИЛ-4 У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АТСМОЙ
© 2007 г. В.А. Казначеев, С.А. Мазурина
НИИ ВС имени И.И. Мечникова РАМН
Бронхиальная астма (БА) является сложным мультифакторным заболеванием дыхательных путей, с которым ассоциированы полиморфизмы в целом ряде генетических локусов. Целью данного исследования было определить частоту полиморфизмов С-590Т и С-1098Т в промоторной области гена интерлейкина-4 (1Ь-4) у жителей Москвы, больных БА и здоровых, выявить возможные ассоциации с тяжестью течения заболевания, а также с такими показателями, как уровень сывороточного 1Ь-4 и общего 1дЕ. Исследовали 109 неродственных больных атопической БА и 74 здоровых неродственных русских по национальности жителей Москвы. Анализ полиморфизма проводили с помощью ПЦР-ПДРФ, уровень 1Ь-4 и общего 1дЕ в крови определяли в стандартных ИФА-наборах. Оказалось, что полиморфизм С-590Т ассоциирован с развитием бронхиальной астмы (Р < 0.001), а также с повышением уровня 1Ь-4 в крови как в группе больных (Р = 0.0009), так и в группе здоровых (Р = 0.03). При этом в группе больных уровень 1Ь-4 у гетерозигот отличался от такового у мутантных гомозигот (Р = 0.015), а в группе здоровых этих отличий не выявлено (Р > 0.05). Ассоциация полиморфизма с повышением уровня общего 1дЕ зафиксирована в группе больных (Р = 0.003), но не в группе здоровых (Р > 0.05). У больных уровень общего 1дЕ отличался во всех трех подгруппах — гомозигот нормального и мутантного типов, а также гетерозигот. В то же время мы не выявили взаимосвязи полиморфизма С-1098Т с интегральным показателем БА (Р > 0.05). Нами не было обнаружено ассоциации полиморфизма С-1098Т с такими количественными параметрами как сывороточный 1Ь-4 и общий 1дЕ (Р > 0.05) как у больных, так и здоровых. Также в группе больных не наблюдались ассоциации обоих полиморфизмов с тяжестью заболевания, и не была зафиксирована корреляция между уровнем сывороточного 1Ь-4 и общего 1дЕ.
Ключевые слова: бронхиальная астма, промоторный полиморфизм, атопия, ИЛ-4, 1дЕ, С-590Т, С-1098Т
ВВЕДЕНИЕ
Бронхиальная астма (БА) является сложным мультифакторным хроническим воспалительным заболеванием и сопровождается увеличением продукции иммуноглобулина Е (1дЕ) [1, 2, 3]. Интерлейкин-4 (1Ь-4) представляет собой плейотропный цитокин, который играет ключевую роль в 1дЕ-зависимых механизмах развития аллергических заболеваний [4]. 1Ь-4, как главный фактор регуляции пролиферативного ответа В-лимфоцитов, регулирует переключение изотипов иммуноглобулинов в них, индуцируя экспрессию 1дС4 и 1дЕ; его часто называют важнейшим цитокином воспаления [4, 5]. !Ь-4, наряду с !Ь-2, выступает также как фактор
Адрес: 105064 Москва Малый Казенный переулок 5а. Телефон/факс: 095-917-20-26. e-mail: Kaznacheevv@mail.ru
роста Т-лимфоцитов и тучных клеток и является ключевым сигналом дифференцировки СБ4 + Т-клеток в хелперы 2 типа [4, 5]. 1Ь-4 представляет собой гликопротеин, состоящий из 153 аминокислотных остатков не считая сигнального пептида (рис 1). Молекулярная масса его около 18 кБ. Ген 1Ь-4 расположен в районе 5д31.1, имеет протяженность около 10 тпн и содержит 4 экзона. Поскольку 1Ь-4 играет центральную роль в развитии аллергического воспаления, анализ генетической регуляции активности этого цитокина имеет очень большое значение для понимания механизмов развития атопии и астмы [6]. Несмотря на привлекательную роль 1Ь-4 в качестве причинного фактора в развитии атопии, данные на этот счет достаточно противоречивы. Ряд исследований подтвердили сцепление астмы и/или атопии с участком 5д31.1 хромосомы [7—11], однако есть и негативные результаты [12—15]. В этой связи
ИНТЕРЛЕИКИН-4
Ехоп 2 Exon 1
G-1098T С-590Т
Prom(-1098)-
Exon 3
Exon 4
Рис. 1. Карта гена 1Ь-4. Ген представлен четырьмя экзонами (представлены в реальном масштабе) и промоторной областью, в которой располагаются искомые полиморфизмы. На карте промоторной зоны изображены замены -590С/Т, - 1098С/Т и образованные сайты узнавания соответствующих рестриктаз
Prom (-590) -antisense
изучение полиморфизмов соответствующих генов представляется интересным для понимания иммуногенетики БА [16—17].
Так, уже известны точечные полиморфизмы в промоторной области гена IL-4 в положении — 590 и —1098 по отношению к первому ATG кодону и представляющие собой транзицию C на T ( — 590) и трансверсию G на Т (— 1098) (рис. 1). Впервые замена С-590Т была обнаружена в 1995 году в популяции американцев [10] и выявлена ассоциация с БА и повышенной концентрацией сывороточного IgE [11]. По данным других авторов полиморфизм С-590Т был ассоциирован с общим уровнем IgE и с положительной реакцией при кожном тестировании больных [14]. Определенный интерес представляет обнаружение полиморфизма G-1098T у больных, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ). Поскольку в литературе имеются суждения о возможной роли РСВ-инфек-ции в формировании бронхиальной гиперреактивности и развитии БА, наличие подобного полиморфизма у больных БА могло бы подтвердить или опровергнуть эту гипотезу [18].
Целью данного исследования было определить частоту полиморфизмов С-590Т и G-1098T у больных БА и здоровых жителей Москвы и выявить возможные ассоциации с тяжестью заболевания, а также с показателями сывороточного уровня IL-4 и общего IgE.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Анализировали образцы ДНК 109 неродственных больных атопической БА, русских по национальности, проходивших лечение в клинико-профилактических учреждениях Москвы в 2003 — 2004 гг., и 74 здоровых не-
родственных русских жителей Москвы. Возраст пациентов был от 17 до 64 лет.
Типирование мутации С-590Т и С-1098Т гена 1Ь-4 проводили методом ПЦР-ПДРФ с использованием следующих праймеров:
Прямой праймер
С-590Т S: 5'- 1а1-дда-сс1-дс1-ддд-асс-саа-ас1-ад С-1098Т R: 5Чда-1;с1;-ддд-дс1;-сс1;-1с1;-с1д-са1;-ад Обратный праймер
С-590Т S: 5'-ссМаМд1;-д1;с-сас-а1д-аа1;-1;с С-1098Т R: 5Чдд-аас-с1а-аас-аса-1;сс-1;са-д
Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 100-200 нг ДНК, 2.5 пмоля каждого праймера, 1 мМ смесь четырех dNTP, 1 мМ МдС12, 0,5 ед./акт. Тад-ДНК-полимеразы ("Силекс", Москва) и 10-х буфер, поставляемый производителем вместе с ферментом. Программа амплификации включала 8 мин предварительной денатурации при 94 °С, 30 циклов: 94 °С-30 с, 55 °С-30 с, 72 °С-30 с. Программу завершала элонгация при 72 °С в течение 8 мин. Продукты амплификации фракционировали в 3%-ном агарозном геле с бромистым этидием в течение 60 мин при напряжении 90 В и визуализировали в УФ-свете.
Наличие мутации в амплифицированном продукте определяли, выявляя сайт рестрикции BsmFI (СССАС) в случае полиморфизма С-590Т и Bst4CI (ACNGT) в случае полиморфизма С-1098Т. Обе рестриктазы гидролизо-вали ампликоны в случае, если имел место дикий тип (рис. 2).
Определение уровня общего 1дЕ проводили методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора "1дЕ-ИФА" производства ООО "ЦКФФ" (г. Ставрополь,
1 2 3 4 5
А) С-590Т В) G-1098T
Рис. 2. Визуализация полученных данных. А) При анализе аллеля мутантного типа — 590ТТ наблюдали продукт рестрикции 150 п.н., а дикого аллеля —590СС — 83 п.н.; В) мутантного типа —1098ТТ — 134 п.н. и дикого аллеля — 1098СС — 92 п.н.
Россия) в соответствии с инструкцией по применению. За нормальный уровень общего IgE у детей принимали значения, соответствующие нормам для данных возрастных групп, у взрослых — значения ниже 100 кЕ/л. Определение уровня сывороточного IL-4 проводили методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора "ProCon IL-4" производства ООО "Протеиновый контур" (г. Санкт-Петербург, Россия) в соответствии с инструкцией по применению. Статистическую обработку проводили с помощью пакета STAT 6,0 [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нами были исследованы полиморфизмы в промоторной зоне гена IL-4 С-590Т и G-1098T на популяции неродственных больных атопи-ческой БА и здоровых неродственных русских жителей Москвы, а также их ассоциация с тяжестью течения БА и такими иммунологическими показателями, как уровень сывороточного IL-4 и общего IgE.
Полиморфизм С-590Т. Частота мутантного аллеля Т была 0.51 в опытной группе и 0.43 — в контрольной. Генотипы в опытной и контрольной группах распределились неравномерно (табл. 1). В группе БА отмечается высокое содержание гетерозигот, составившее 68,8% от общего числа обследуемых. Ассоциацию полиморфизма с уровнем сывороточного IL-4 и общего IgE определяли отдельно в опытной и контрольной группе с
помощью теста Крускала-Уоллиса. Было показано, что уровень сывороточного 1Б-4 зависит от мутации в искомой точке как в опытной Р = 0.00091, так и в контрольной Р = 0.03 группах (рис. 3). Проведены внут-ригрупповые сравнения уровня 1Б-4 среди носителей трех генотипов в искомой точке, для этого использовали тест Манна-Уитни с поправкой Бонферони. Внутригрупповое сравнение выявило, что среди пациентов с БА и в контрольной группе величина этого параметра в заметной степени варьирует. Так, сравнение попарно генотипов СТ-ТТ и СС-ТТ выявило зависимость с вероятностью Р = 0.015 и Р = 0.000 в группе больных БА, в то время как в контрольной группе такой зависимости обнаружено не было (Р = 0.864 и Р = 0.590 — соответственно). Довольно интересные результаты получены при исследовании уровня общего 1дЕ (рис. 3). Оказалось, что влияние полиморфизма С-590Т на уровень 1дЕ значимо в опытной Р = 0.003178, но не в контрольной группе Р > 0.08. Внутригрупповые сравнения показали, что уровень общего 1дЕ в опытной группе значимо различается у носителей всех трех генотипов с достоверностью Р < 0.003 при сравнении каждой пары. Среди пациентов с БА этот параметр отличался во всех трех генотипных подгруппах: наличие Т аллеля содействовало увеличению 1дЕ.
Полиморфизм С-1098Т. Частота мутантного аллеля Т составила 0.16 в группе больных БА и 0.09 в контрольной группе. Мы не выявили взаимосвязи полиморфизма С-1098Т с интегральным показателем БА (Р > 0.05). Не было также обнаружено ассоциации исследованного полиморфизма С-10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.