РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, С. 83-89
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ПРИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ
ИНФЕКЦИЯХ У МУЖЧИН
© 2009 г. А.Г. Луцюк*, А.В. Шабалдин**, Г.В. Лисаченко***, Ю.Г. Климчук***, Т.В. Земерова***
*ГУЗ «Областной кожно-венерологический диспансер» г. Кемерово, Россия;
**Институт угля и углехимии СО РАН, Кемерово, Россия; ***ГОУ ВПО КемГМА Росздрава, Россия Поступила: 25.12.08 г. Принята: 02.02.09 г.
Изучен полиморфизм в генах ШШа и 1Ь4 при инфекциях, передаваемых половым путем (ИППП), у мужчин. Генотип IL1Ra*2R,2R был положительно ассоциирован с грам( + ) ИППП. Генотип IL1Ra*4R,4R был положительно ассоциирован с генитальным герпесом. Генотип IL4*3R,3R и сочетанный генотип IL1Ra*4R,4R/IL4*3R,3R были положительно ассоциированы с грам(-) ИППП.
Ключевые слова: полиморфизм, гены 1Ь4 и рецепторного антагониста Ш1, инфекции, передаваемые половым путем
ВВЕДЕНИЕ
За последние 30 лет в мире отмечается стойкая тенденция к распространению уро-генитальных инфекций «нового поколения». В первую очередь это относится к микроорганизмам с внутриклеточной локализацией, которые преимущественно передаются половым путем: Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum [1 — 3]. Огромное значение также имеет Neisseria gonorrhoeae и Trichomonas vaginalis [4, 5].
В настоящее время урогенитальный хла-мидиоз встречается в 2 — 3 раза чаще, чем гонорея, и в 7,5 раз чаще, чем сифилис [6]. Его доля в структуре негонококковых уретритов оценивается в 40 — 70%. Им поражено не менее 5—10% сексуально активных людей [1]. Генитальные микоплазмы, по материалам литературы, являются причиной около 40% воспалительных заболеваний мочеполовых органов, особенно у женщин в период беременности [7, 8]. Показатели инфицированности Ureaplasma urealyticum в некоторых регионах России достигает 80% [9]. Высока частота и генитальных инфекций, обусловленных простым герпесом. Это связано с 90% инфицированием человеческой популяции вирусом простого гер-
Адрес: E-mail: Weit2007@yandex.ru
песа, который пожизненно персистирует в организме человека, обуславливая значительный полиморфизм клинических проявлений герпетической инфекции, и формируя торпидность к существующим методам лечения [10].
Одной из причин заражения инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП), может быть не состоятельный иммунный ответ на инфекционную стимуляцию [11]. Важными иммунорегуляторными молекулами являются цитокины, которые активируют процессы фагоцитоза, процессинга и презентации антигенов, а также действуют на Т-регуляторные клетки, обеспечивая, тем самым, эффективность гуморального и/или клеточного иммунного ответа [12]. Для цитокинов, влияющих на первичный и вторичный иммунный ответ (интерлейкины 1 и 4), выявлен генетический полиморфизм, особенности локализации которого влияют либо на функциональную активность, либо на экспрессию этих молекул [13—15], но, в конечном счете, полиморфизмы ассоциированы с иммунопатологией [16, 17]. Не исключено, что в высоко полиморфном гене рецепторного антагониста интер-лейкина 1 (IL1Ra) и гене интерлейкина 4 (IL4) могут встречаться маркеры чувствительности к различным по этиологии ИППП. В исследовательских работах были обнаружены положительно ассоциированные генотипы IL4 с Ureaplasma urealyticum [18, 19], что указывает
на перспективность такого рода поиска. В то же время, для большинства иммуногенетиче-ских локусов были показаны, как популяци-онная пенетрантность, так и этнические особенности в иммуногенетических ассоциациях [20].
Исходя из этого, целью настоящей исследовательской работы было изучение ассоциаций полиморфизмов в генах 1ЬШа и 1Ь4 с урогенитальными инфекциями у мужчин Кемеровской области.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для выполнения поставленной задачи было обследовано 231 человек. Из них 199 индивидуумов обратились в Областной кожно-венерологический диспансер либо с жалобами на поражение мочеполовых органов, либо с указанием на ИППП у полового партнера. Группу сравнения составили 32 здоровых донора, сопоставимых по возрасту. Вся группа состояла из лиц мужского пола. Средний возраст обследуемых — 27 лет. В процессе обследования пациенты Областного кожно-венерологического диспансера были разделены на группы по этиологии урогенитальной инфекции.
Для диагностики ИППП применялись микроскопический, бактериологический, серологический и молекулярно-генетические методы исследования биологического материала.
Диагноз трихомониаз был выставлен в результате просмотра нативных препаратов при микроскопии препаратов, окрашенных мети-леновым синим или по Граму, Романовскому-Гимзе, и подтвержден бактериологическими методами, такими как выращивание трихомо-над в букальной культуре.
Для диагностики хламидиоза применялись методы полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами (ПЦР), прямая иммуно-флуоресценция (ПИФ) и иммуно-ферментный анализ антител к исследуемым возбудителям (ИФА). Результат считали положительным если у одного и того же пациента возбудитель хламидиоза определялся тремя различными методами.
Уреа-микоплазменная инфекция была обнаружена методами бактериологических посевов на питательных средах, а также методами: ПЦР, ПИФ, ИФА.
Методы ПЦР и ИФА явились основополагающими для обнаружения вируса простого герпеса.
У всех обследованных забирали венозную кровь, из лимфоцитов которой выделяли геномную ДНК с помощью метода фенол-хлороформной экстракции, образцы ДНК растворяли в 10 mM Tris/1 EDTA, pH 8.0 и хранили при 4° C [21].
Для исследования полиморфизма ILlRa проводили ПЦР с помощью праймеров фланкирующих полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находятся вариабельное количество тандемных повторов — 86 н.п. (VNTR). Для амплификации использовали олигонуклеотидные прайме-ры IRAI CCCACTCATGGCCTTGTTC и IRA2 GGCTCAATGGGTACCACATC, выбранные с помощью программы GENERUNNER на основании нуклеотидной последовательности гена ILlRa (GENEBANK, U65590). В результате амплификации детектировали фрагменты ДНК размером 438, 524, 610, и 696 н.п. с 2, 3, 4 или 5 тандемными повторами (repaid — R), соответственно. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R и 5R (рис. 1).
Для VNTR IL4 использовался метод ПЦР с праймерами фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находятся вариабельное количество тандемных повторов — 70 н.п. (VNTR): 5' GG C TAC TGT GTG GTA AAT AG 3' и 5' CCT ACA ACC GAT CTG TCA GG 3'. В результате амплификации детектировали фрагменты ДНК размером 255 и 325 н.п. с 2 и 3 тандемными
2R/5R 2R/4R 2R/4R 2R/4R 4R/5R м.в.
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации УЫТЯ 1ЬШа в 6%-ном полиакриламидном геле. Дорожки обозначены полученными генотипами. Крайне правая дорожка — маркер молекулярного веса, представленный ДНК плазмиды рВ1и8спр18КП, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции Мвр!.
3R/3R 2R/2R 2R/3R м.в
1
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации VNTR IL4 в 6%-ном полиакриламидном геле. Дорожки обозначены полученными генотипами. Крайне правая дорожка — маркер молекулярного веса, представленный ДНК плазмиды pBluscriptSKII, гидролизованная эн-донуклеазой рестрикции MspI.
повторами, соответственно. Эти аллели были обозначены как 2R и 3R (рис. 2).
Ввиду того, что характер иммунного реагирования на ксенобиотик зависит от его качеств, в представленном исследовании объединили ряд инфекций в отдельные группы: грамположительные (грам( + )) инфекции, грамотрицательные (грам( — )) инфекции, вирусные инфекции (генитальный герпес) и простейшие (трихомониаз). В группу грам( + ) вошли пациенты с ИППП, у которых были обнаружены представители условно-патогенной флоры: Staphylococcus aureus, Streptococcus haemolyticus, неидентифицированные палочки, гарднереллы, mobilunkus, лептотрихии. Группа грам(-) была сформирована из больных с урогенитальными инфекциями этиологию которых определяли: условно-патогенная грам( —) флора (Enterobakter aerogenus, Proteus klebsiella и энтерококки), а также хла-мидия трахоматис, уреаплазма уреалитикум, микоплазма гоминис и гениталиум. Отдельно были выделены группы: с трихомониазом, так как данный возбудитель относится к простейшим; и с генитальным герпесом, как представителем вирусных ИППП.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью стандартных генетико-статистических методов, используя пакета прикладных программ «Statistika for WINDOWS 5.0». В соответствии с равновесием Харди-Вайнберга, провели сопоставле-
ние частот аллелей и генотипов генов 1ЬШа и 1Ь4 исследуемых групп с группой сравнения, используя критерий Фишера для малых выборок, а также по хи-квадрату с поправкой Йетса на непрерывность [22, 23]. Для каждого полученного достоверно значимого различия рассчитывали относительный фактор риск — ИИ, и его доверительный интервал (С1) при 95%-ном уровне значимости [22]. Считали ассоциацию положительной если ИИ был больше 2. Результаты считали достоверными при ошибке менее 5%, что соответствует медико-биологическим исследованиям [23].
РЕЗУЛЬТАТЫ
При исследовании полиморфизма гена 1ЬШа было обнаружено, что во всех группах встречались аллели 4И и 2И (табл. 1). Аллель 3И в настоящем исследовании не детектировался. Аллель 5И выявлялся лишь в группе сравнения с частотой 3% и у пациентов с острой герпетической инфекцией в 2,5% случаев. Достоверно значимые различия по частоте аллелей обнаружены при их сопоставлении в группе сравнения и в группе грам( + ). Так, 2И аллель достоверно чаще встречался при грам( + ) ИППП, чем у здоровых доноров (68,5% против 31,2%; р < 0,001; ИИ = 4,68; С1 = 1,8 — 12,5), а 4И — напротив, в группе сравнения (31,4% против 65,6%, р < 0,05).
При исследовании частот встречаемости генотипов 1ЬШа в сравниваемых группах выявлено следующее. Достоверные различия были выявлены для УЫТИ генотипов 1ЬШа. Из 35 пациентов с грам( + ) ИППП — 63% имели генотип 1ЬШа*2К,2К, а у 32 здоровых доноров этот генотип не выявлялся (р < 0,001;
108,3; С1 = 42,7 - 274,6). Из 19 пациентов с острым генитальным герпесом 89% имели генотип 1ЬШа*4К,4К, в то время как в группе сравнения
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.