провоспалительных цитокинов. Поскольку известно, что при данной патологии В-клетки активно инфильтрируют ЦНС, данный эффект может вносить вклад в развитие нейро-воспалительных процессов, служащих основной причиной демиелинизации.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 14-04-96007).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Matsushita T., Yanaba K, Bouaziz J. D., Fujimoto M., Tedder T. F. J. Clin. Invest. 2008, 118, 3420-3430.
2. Hauser S. L. Waubant E., Arnold D. L., Vollmer T., Antel J., Fox R. J., Bar-Or A., Panzara M., Sarkar N., Agarwal S., Langer-Gould A., Smith C. H. N. Engl. J. Med. 2008, 358, 676-688.
3. Stuve O., Leussink V. I., Frohlich R., Hemmer B., Hartung H. P., Menge T., Kieseier B. C. Arch. Neurol. 2009;66, 259-261.
4. Good K. L., Avery D. T., Tangye S. G. J. Immunol. 2009;182,890-901.
5. Magliozzi R., Howell O., Vora A., Serafini B., Nicholas R., Puopolo M., Reynolds R., Aloisi F. Brain, 2007, 130, 1089-1104.
STUDYING THE B LYMPHOCYTE FUNCTIONS DISTINCT OF ANTIBODY PRODUCTION IN MULTIPLE SCLEROSIS
Kuklina Е. М., Nekrasova I. V., Baidina ^ V., Danchenko I. Y.
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms the Ural Branch of the Russian, *Perm State Medical Academy named after Academician E. A. Vagnera Russian Ministry of Health, Perm,
The key cytokine synthesis by B lymphocytes in multiple sclerosis, as well as potential antigen presenting ability of the cells have been studied. The levels of proinflammatory cytokines in such a patients was shown to increase in comparison with the same indications in healthy donors, whereas the level of antiinflammatory one was decreased. The expression of costimulating molecules and HLA-DR, that are important for effective antigen presentation, was comparable in patients and healthy donors. The data obtained suggest the implication of B lymphocyte antibody-independent functions in multiple sclerosis progression, namely, by cytokine producing and promoting the inflammation, including in central nervous system.
Key words: B-lymphocytes, cytokines, antigen presentation, multiple sclerosis, autoimmunity
УРОВЕНЬ РАСТВОРИМОГО SEMA4D У ПАЦИЕНТОВ С РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ
Куклина Е. М., Некрасова И. В., Байдина Т. В.1, Данченко И.Ю.1, Лопатина В. А.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН; 'ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е. А. Вагнера» Минздрава России; Пермь, Россия
В работе определен уровень растворимого семафорина Sema4D в сыворотке крови пациентов с РС и в культуре интактных и активированных Т-лимфоцитов таких пациентов, а также проведено его сопоставление с экспрессией Т-клетками мембранной формы данного семафорина. Установлено повышение сывороточного уровня Sema4D при рассеянном склерозе, наиболее выраженное у пациентов в стадии обострения, а также существенное увеличение его образования в 18-часовой культуре лимфоцитов. Эти результаты согласуются с полученными нами ранее данными об усилении экспрессии мембранной формы семафорина Т-лимфоцитами пациентов с рассеянным склерозом. Учитывая способность Sema4D индуцировать в модельной системе in vitro апоптоз нейрональных предшественников и незрелых олигодендроцитов, полученные нами данные указывают на возможное участие Sema4D в развитии рассеянного склероза.
Ключевые слова: семафорины, sSema4D, Т-лимфоциты, рассеянный склероз, аутоим-мунитет
Семафорин IV класса Sema4D является многофункциональной молекулой, играющий активную регуляторную роль как в нервной, так и в иммунной системах организма [1, 2]. Он представляет собой трансмембранный белок, который экспрессируется в иммунной системе преимущественно Т-лимфоцитами и способен переходить в растворимую форму (soluble Sema4D, sSema4D) в результате протеолити-ческого отщепления от мембраны [3]. Целый ряд данных литературы указывает на участие этого фактора в развитии рассеянного склероза (РС) - нейровоспалительного дегенеративного заболевания, ассоциированного с де-миелинизацией нервных волокон. Так, мыши, дефицитные по экспрессии Sema4D, устойчивы к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита - модели РС у мышей [2], а мы в недавних исследованиях выявили повышенный уровень экспрессии данного се-мафорина Т-лимфоцитами периферической крови пациентов с ремиттирующей формой РС [4]. При этом ключевую роль в данном процессе играет, по-видимому, именно растворимая форма семафорина, поскольку трансгенная экспрессия укороченной формы Sema4D, обеспечивающая ее спонтанное отщепление от мембраны, напротив, способствует развитию данной патологии у животных [5].
Цель настоящей работы - оценить уровень растворимого Sema4D в сыворотке крови пациентов с РС и в культуре фракционированных Т-лимфоцитов таких пациентов, а также сопоставить его с экспрессией Т-клетками мембранной формы данного семафорина.
В работе исследовали лейкоциты пациентов с достоверным диагнозом «Рассеянный склероз» согласно пересмотренным критериям МакДональда 2010 года, тип течения заболевания ремитпирующий.
Пациенты не подвергались терапии препаратами, изменяющими течение рассеянного склероза. Забор материала для исследования производился на стадии клинической ремиссии, при отсутствии воздействия гормонотерапии в течение 30 дней до взятия образцов периферической крови, а также на стадии обострения. Средний возраст пациентов -28,4 ± 1,91 лет, средний стаж заболевания -3,54 ± 0,871. В качестве контроля использовали лейкоциты здоровых доноров (средний возраст 28,2 ± 1,64 лет). Сыворотку крови для анализа растворимого Sema4D получа-
ли центрифугированием венозной крови при 3000 об/мин в течение 5 мин. Содержание sSema4D оценивали иммуноферментным анализом (R&D). Лейкоциты выделяли из гепа-ринизированной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 г/см3). Полученную суспензию монону-клеарных клеток использовали далее для определения экспрессии семафорина Sema4D (CD 100) Т-лимфоцитами. Определение проводилось проточной цитометрией с помощью соответствующих моноклональных антител: анти^100*РЕ (Biolegend), анти^3*РЕ/ Cy7, анти^4^8^1ТС (Beckman Coulter). При этом оценивали как процент CD100-по-зитивных Т-клеток, так и уровень экспрессии на клетках данного маркера, определяя среднюю интенсивность свечения (Middle Fluorescence Intensity, MFI; условные единицы). Наряду с этим, для Т-лимфоцитов экспрессию Sema4D определяли после 18-часового культивирования (2-106 клеток/мл) в среде RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva), 300 мкг/мл L-глутамина (Serva), 0,01М HEPES (Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (Pharmacia, Швеция) при 37° и 5% СО2. В качестве активатора Т-клеток использовали форболмиристата-цетат (ФМА, Sigma; 10 нг/мл). По окончании культивирования определяли уровень растворимого Sema4D в супернатанте клеточной культуры (иммуноферментным анализом), а также экспрессию мембранной формы се-мафорина на Т-лимфоцитах (CD3+-клетках). Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Анализ уровня sSema4D в сыворотке крови выявил его достовенное повышение при РС, причем у пациентов в фазе обострения он был статистически значимо выше соответствующего показателя как у здоровых доноров, так и у пациентов, находящихся в стадии ремиссии (концентрация sSema4D, пмоль/мл: 2,27 ± 0,014 - здоровые доноры; 4,89 ± 1,01 - пациенты с РС, ремиссия, p < 0,05 (в сопоставлении со здоровыми донорами); 6,38 ± 1,14 - пациенты с РС, обострение, p < 0,05 (в сопоставлении со здоровыми донорами и с пациентами в стадии ремиссии). Этот результат вполне закономерен: одновременная оценка экспрессии мембранной формы Sema4D выявила повышенный уровень данного семафорина при РС на лейкоцитах, преимущественно на Т-лим-
фоцитах периферической крови (экспрессия $еша4Б на СБ3+-клетках, МИ, отн. ед.: 95,6 ±
13.3 - здоровые доноры; 187 ± 32,7 - пациенты с РС, ремиссия, р < 0,05), хотя доля Т-лим-фоцитов, несущих на мембране Sema4D (СБ3+ СБ100+- клеток), статистически значимо не различалась между группами.
Интересно отметить, что в супернатан-тах 18-часовой культуры интактных Т-лим-фоцитов уровень sSema4D был на порядок выше такового в сыворотке (концентрация sSema4D, пмоль/мл: здоровые доноры: 2,27 ± 0,014 - сыворотка, 29,4 ± 5,25 - супернатант 18-часовой культуры, р < 0,05). Поскольку известно, что растворимая форма Sema4D образуется за счет протеолитического отщепления семафорина от мембраны, катализируемого металлопротеиназами [3], полученные данные позволяют предположить, что лимфоциты способны спонтанно синтезировать данные ферменты в культуре. При этом у пациентов с РС, находящихся в стадии ремиссии, содержание sSema4D в супернатанте клеточной культуры было сопоставимо с таковым для здоровых доноров (концентрация sSema4D, пмоль/мл:
29.4 ± 5,25 - здоровые доноры; 24,3 ± 3,45 -пациенты с РС, ремиссия, р > 0,05). Ранее мы показали, что уровень мембранного Sema4D на Т-лимфоцитах также возрастает в случае культивирования клеток - как у здоровых доноров, так и у пациентов с РС [4]. Очевидно, повышение экспрессии растворимого Sema4D в ходе культивирования лимфоцитов - следствие усиленного синтеза и экспрессии его мембранной формы на Т-клетках.
В условиях активации экспрессия семафо-рина на мембране Т-лимфоцитов в культуре снижалась по сравнению соответствующим показателем для интактных Т-клеток [4], причем для пациентов с РС это снижение было статистически значимо более выраженным [4], поэтому при исследовании уровня растворимого Sema4D в супернатантах соответствующих клеточных культур логично было ожидать реципрокного повышения данного показателя. Однако эти ожидания не оправдались: уровни sSema4D в активированной культуре, хотя и демонстрировали тенденцию к повышению, статистически значимо не изменялись по сравнению со спонтанным вариантом ни у здоровых доноров, ни у пациентов с РС (концентрация sSema4D, пмоль/мл: здоровые доноры - 29,4 ± 5,25 для интактных
клеток и 33,8 ± 3,76 для активированных, p > 0,05 (в сопоставлении со спонтанным вариантом); пац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.