ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СУПЕРНАТАНТОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA И ESCHERICHIA COLI НА ФАГОЦИТОЗ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА
Кузнецова М. В., Масленникова И. Л., Демаков В. А.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Цель работы - изучить фагоцитарную активность нейтрофилов человека после воздействия супернатантов моновидовых и смешанных культур P. aeruginosa и E. coli. Фагоцитарная активность нейтрофилов определялась по ингибированию биолюминесценции E. coli lux+, поглощаемых нейтрофилами. Показано, что супернатанты моновидовых культур P. aeruginosa ингибировали индекс фагоцитарной активности нейтрофилов дозоза-висимо от концентрации пиоцианина. Выявлен стимулирующий эффект на фагоцитоз нейтрофилов супернатантов смешанных культур P. aeruginosa и E. coli, обусловленный как снижением количества пиоцианина, так и, вероятно, увеличением ЛПС грамотрицатель-ных бактерий.
Ключевые слова: супернатанты, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, фагоцитоз, нейтрофилы
Особое положение среди госпитальных осложнений занимают инфекции полимикробной этиологии, в том числе с участием Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli [1]. В данном сообществе, как и в большинстве случаев с другими микроорганизмами, синег-нойная палочка занимает доминантные позиции, определяя активность инфекционного процесса. Фенотипическая гетерогенность внутрибольничных популяций P. aeruginosa, проявляющаяся при взаимодействии с E. coli в составе ассоциации, может приводить к различным эффектам на функции клеток, участвующих в иммунной защите. Нейтрофилы играют центральную роль во врожденном иммунитете. Наиболее важной функцией ней-трофилов является фагоцитоз бактериальных клеток [2, 3]. Оценка фагоцитарного процесса, который может нарушаться при септических инфекциях синегнойной этиологии, является актуальной.
Цель работы - изучить фагоцитарную активность нейтрофилов человека после воздействия супернатантов моновидовых и смешанных культур P. aeruginosa и E. coli.
Материал и методы. В работе использовали референтный штамм P. aeruginosa АТСС 27853 (получен из ГИНСК), нозокомиальные изоля-ты P. aeruginosa 9-1 (сессильный) и 9-3 (план-
ктонный), а также штамм E. coli К12 lux+ [4]. Супернатанты отбирали путем фильтрации (диаметр пор 0.2 мкм, «Хийу Калур», Эстония) после 20 ч культивирования бактериальных культур в моно- и микст-варианте (P aeruginosa и E. coli) в среде Луриа-Бертани (LB-среде) при 37°С в 96-луночном планшете. Продукцию пиоцианина определяли спектро-фотометрическим методом согласно Deziel E. et al. [5], экзополисахаридов - согласно Qin Z. et al. [6]. Объектами исследования являлись сепарированные нейтрофилы периферической крови здоровых доноров (мужчины, n=7), выделенные на двойном градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 и 1.112 г/ мл). Отмытые нейтрофилы (107 кл/мл) ре-суспендировали в 300 мкл RPMI, к которым добавляли по 500 мкл супернатантов, LB или RPMI в качестве контроля и выдерживали 1 ч при 37°С в СО2 инкубаторе. Затем нейтрофи-лы отмывали и ресуспендировали в 750 мкл раствора Хенкса и составляли фагоцитарную смесь: суспензия нейтрофилов (106 кл/мл), ре-гидратированный сенсор E. coli lux+ (107 кл/мл) c lux-опероном Photorhabdus luminescens [4], пул сывороток для опсонизации (5%). Оценку биолюминесценции проводили на многофункциональном планшетном ридере (Synergy H1, США) через каждые 10 мин в течение 30
816
Инфекционная иммунология
мин. Данные представлены в виде индекса фагоцитарной активности (ИФА), который вычисляли по формуле: ИФА= (X1-X2) /X1x100%, где X1, - интенсивность исходного свечения сенсора фагоцитарной системы, X2 - свечение в определенный момент времени, согласно методике [7]. Результаты обработаны по парному t-критерию Стьюдента с использованием программы Excel.
Результаты. Установлено, что фагоцитарная активность нейтрофилов после экспозиции с супернатантом E. coli не отличалась от контроля, тогда как с супернатантами P. aeruginosa снижалась у штамма АТСС и штамма 9-3 через 10 мин (табл.). Супернатанты смешанной культуры P. aeruginosa АТСС повышали ИФА нейтрофилов по сравнению с RPMI и монокультурой на 10 и 30 мин. В варианте смешанной культуры с супернатантом штамма 9-3 с предоминантной планктонной формой существования показано увеличение фагоцитарной активности только в ранний срок, с су-пернатантом штамма 9-1 с предоминантной сессильной формой существования достоверных различий между моно- и смешанной культурами не выявлено.
Для определения возможного участия эк-зопродуктов в активации нейтрофилов было оценено содержание пиоцианина, пиоверди-на, экзополисахаридов в супернатантах моновидовых и смешанных культур P. aeruginosa и E. coli. Для штаммов P. aeruginosa АТСС, 9-1, 9-3 в моно- и смешанных вариантах количество пиоцианина составило: 3.34 и 2.60; 1.63 и 1.50; 3.77 и 3.63 мкг/мл соответственно; концентрация экзополисахаридов - 1.57 и 0.71; 1.89 и 0.63; 3.12 и 1.57 мг/мл соответственно. Продукция пиовердина в моновидовых и сме-
шанных культурах штаммов снижалась в ряду 9-1 > 9-3 > АТСС.
Обсуждение. Для преодоления системы антибактериальной защиты хозяина/макроорганизма в арсенале P. aeruginosa имеется значительное число факторов, как ассоциированных с клеточной стенкой, так и экстра-целлюларных продуктов. Известно, что пио-цианин дозозависимо ингибирует фагоцитоз нейтрофилов [8]. В настоящей работе подобный эффект пиоцианина реализуется и в составе супернатантов моновидовых культур P. aeruginosa, где его концентрация превышала 3 мкг/мл. Ранее показано, что пиоцианин в концентрации, оказывающей проапоптотическое действие на нейтрофилы, снижает их количество и функциональную активность [9].
Выявленный стимулирующий эффект на фагоцитоз нейтрофилов супернатантов смешанных культур P. aeruginosa АТСС и 9-3 по сравнению с моновидовой и контролем может быть обусловлен снижением количества пиоцианина, а также протеазы и эла-стазы P. aeruginosa, связанных в кворум-сенсинге. Последние подавляют активность миелопероксидазы - одной из главных антибактериальных систем нейтрофилов [10]. Еще одним фактором, влияющим на интенсивность фагоцитоза, может выступать ЛПС грамотрицательных бактерий [11]. Его появление/увеличение в составе супернатантов смешанных культур, вероятно, обусловлено антагонистической активностью при совместном росте.
Выводы.
1. Фагоцитарная активность нейтрофилов может быть изменена при воздействии супер-натантов моновидовых и смешанных культур
Время, Контроль E. coli P. aeruginosa
мин АТСС 9 1 9-3
RPMI LB моно микст моно микст моно микст
№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 18,0±2,9 23,7±2,5 19,2±2,9 15,6±2,3 р(4-2) <0,05 26,0±4,9 р(5-1) <0,05 р(5-4) <0,05 18,1±4,4 21,4±4,5 15,4±1,9 р(8-2) <0,05 22,9±3,5 р(9-ц <0,05 р(9-8) <0,05
30 27,4±2,3 29,0±2,6 30,6±4,4 25,7±3,2 32,7±2,6 р(5-1) <0,05 р(5-4) <0,05 25,2±2,2 28,1±4,7 23,2±2,3 28,4±2,9 р(9-5) <0,05
Таблица. Индекс фагоцитарной активности нейтрофилов человека при действии супернатантов моновидовых и смешанных культур P. aeruginosa и E. coli.
P. aeruginosa, причем эти изменения имеют противоположную направленность.
2. Характер изменения ИФА в смешанной культуре зависит от соотношения экзопродук-тов (пиоцианина, липополисахаридов и других факторов), количество которых определяется уровнем антагонистической активности между ассоциантами.
Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-01300.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ustin J. S., Malangoni M. A. Crit. Care Med. 2011, 9, 2156-2162.
2. Elbim C., Lizard G. Cytometry. 2009, 75, 475-481.
3. Gilroy D. W., Lawrence T., Perretti M., Rossi A. G. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3, 401-416.
4. Данилов В. С., Зарубина А. П., Ерошникова Г. Е., Соловьева Л. Н., Карташев Ф. В. и др. Вестник МГУ. Биология 2002, 3, 20-24.
5. Deziel E., Comeau Y., Villemur R. J. Bacteriol. 2001, 183,1195-1204.
6. Qin Z., Yang L., Qu D., Molin S., Tolker-Nielsen T. Microbiology 2009, 155, 2148-2156.
7. Ширшев С. В., Куклина Е. М., Заморина С. А., Некрасова И. В., Никитина Н. М. Патент РФ № 2292553 от 21.01.2007. Бюлл. № 3. 7с.
8. Bianchi S. M., Prince L. R., McPhillips K., Allen, L., Marriott H. M. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008, 177, 35-43.
9. Usher L. R., Lawson R. A., Geary I., Taylor C. J., Bingle C. D. et al. J. Immunol. 2002, 168, 1861-1868.
10. Kharazmi A., H0iby N., Döring G., Valerius N. H. Infect Immun. 1984, 44, 587-91.
11. Böhmer R. H., Trinkle L. S., Staneck J. L. Cytometry 1992, 13, 525-531.
THE INFLUENCE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA AND ESCHERICHIA COLI BACTERIAL SUPERNATANTS ON HUMAN NEUTROPHILS PHAGOCYTOSIS
Kuznetsova M. V., Maslennikova I. L., Demakov V. A.
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Perm, Russia
The aim of the work was to evaluate the phagocytic activity of human neutrophils after exposure of P. aeruginosa and E. coli monocultures and mixed cultures supernatants. The phagocytic activity of neutrophils was determined by inhibition of E. coli lux+ bioluminescence absorbed by neutrophils. It is shown that P. aeruginosa monocultures supernatants inhibited neutrophil phagocytic activity index dose dependently on the concentration of pyocyanin. A stimulating effect of P. aeruginosa and E. coli mixed cultures on neutrophil phagocytosis supernatants was revealed and it was due to both a decrease in the pyocyanin amount and probably increase of the gram negative bacteria LPS.
Key words: supernatants, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, phagocytosis, neutrophils
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.