научный журнал по химии Биохимия ISSN: 0320-9725

БЕРНХАРД М.К., УЛЬРИХ К. — 2006 г.

К настоящему времени идентифицировано семь рецепторов Р2Х и пятнадцать рецепторов P2Y, часть из них на основе гомологии аминокислотных последовательностей. Уровень экспрессии всех клонированных пу-ринэргических рецепторов Р2 человека изучали, измеряя количество соответствующих мРНК в промоно-цитах U937, эритробластах К562 и в клетках HL60: недифференцированных, ДМСО-дифференцированных гранулоцитах и ФМА-дифференцированных моноцитах. ОТ-ПЦР-анализ показал, что в этих клетках экспрессируются некоторые рецепторы Р2Х, тогда как все рецепторы P2Y были обнаружены, по крайней мере, в одной из проанализированных линий клеток. Гранулоцитарная или моноцитарная дифференциация клеток HL60 приводила к значительному усилению или ослаблению транскрипции рецепторов. Наименьшее количество экспрессируемых Р2-рецепторов было обнаружено в клетках U937. Их число увеличивалось в клетках К562, недифференцированных в гранулоциты, и еще больше возрастало в клетках HL60. Сравнение препаратов суммарной мРНК, нормализованных по уровню ГАФД, показало значительные различия между уровнями транскрипции в различных типах клеток. Увеличение числа различных экспрессируемых рецепторов Р2 было связано с увеличением общего усредненного количества мРНК рецептора Р2 в каждой клетке. Это явление суперэкспрессии предполагает самоиндукционное влияние пуринэргического способа передачи сигнала, что указывает на его участие в гемопоэзе и, возможно, в развитии иммунного ответа.

ВЫСОКИХ М.Ю., ЕМЕЛЬЯНОВ В.В. — 2006 г.

Иммуноблоттингом белков целых клеток и мембранных фракций с моноклональными антителами к пори-ну VDAC 1 митохондрий животных в клетках Rickettsia prowazekii обнаружен митохондриальный порин. С, использованием BLAST-сервера показано, что гомологичная митохондриальному порину последовательность в риккетсиальных геномах отсутствует. У риккетсий также не обнаружен собственный порин. Отме- чено, что импортируемый R. prowazekii белок слабо экстрагируется неионными детергентами и, подобно по- рину в митохондриях, нечувствителен к протеиназе К в составе целых клеток. Иммуноцитохимическим анализом показано, что этот белок локализован во внешней мембране бактериальных клеток. Эти данные1 подтверждают высказанное ранее предположение об импорте риккетсиями необходимых белков из цито- плазмы хозяйской клетки как молекулярной основе облигатного внутриклеточного паразитизма. Они также согласуются с гипотезой о переносе генов, кодирующих поверхностные белки, от последнего общего предка риккетсий и митохондрий в хозяйский геном и о сохранении риккетсиями примитивной способности импортировать эти белки

ОВОДОВ Ю.С. — 2006 г.

В обзоре рассматривается роль К-антигенов бактерий, которые представляют собой капсульные полисаха- риды и экзогликаны, в патогенности и вирулентности бактерий. Подробно обсуждается использование К- антигенов в качестве основы для получения вакцин против тяжелых заболеваний, вызываемых капсулиро- ванными микроорганизмами. Описано использование конъюгатов капсульных полисахаридов и их фраг ментов с белками и пептидами для синтеза вакцин, а также применение липосом в качестве адъювантов для К-антигенов.

ОВОДОВ Ю.С. — 2006 г.

В обзоре приведены данные о структуре К-антигенов бактерий, которые представлены капсульными полисахаридами и экзогликанами и которые, обладая иммуногенной активностью, определяют типовую специфичность бактерий.

БРУСНИЧКИН А.В., ВЛАДИМИРОВ Ю.А., ИЗМАЙЛОВ Д.Ю., КАГАН В.Е., НОВИКОВ А.A., ОСИПОВ А.Н., ПРОСКУРНИНА Е.В. — 2006 г.

Изучено влияние липосом, состоящих из тетраолеилкардиолипина и диолеилфосфатидилхолина (1:1, моль/моль), на скорости еще трех реакций гема цитохрома с с Н202: окисления цитохрома с (Fe2+) до цито- хрома с (Fe3+), разрушения связи Fe...S(Met80) и разрушения порфиринового кольца гема. Обнаружено, что скорости всех этих реакций во много раз увеличивались в присутствии липосом, содержащих кардиолипин (но не липосом, состоящих из одного фосфатидилхолина), причем примерно в той же степени, что и перок- сидазная активность. Эти данные показывают, что кардиолипин специфически активирует пероксидазную активность цитохрома с не только потому, что способствует разрыву связи Fe-S(Met80), но и потому, что. облегчает проникновение Н202 к реакционному центру.

ВРЖЕЩ П.В., КАРАТАССО Ю.О., ФИЛИМОНОВ И.С., ЦАПЛИНА Л.А. — 2006 г.

Фермент простагландин-Н-синтаза (PGHS, К.Ф. 1.14.99.1) катализирует превращение молекулы арахидо-новой кислоты в простагландин Н2 и обладает двумя активностями - циклооксигеназной и пероксидазной. Отсутствие конкурентных взаимоотношений и взаимная активация этих двух реакций не находят своего объяснения в рамках традиционно используемых кинетических схем. Проанализировано влияние различных доноров электронов (N,N,N',N'-тетраметил-n-фенилендиамина, ферроцианида калия, L-адреналина, двуаммониевой соли 2,2'-азино-ди(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты)) на скорость циклооксигеназной реакции фермента PGHS. Предложена кинетическая модель действия фермента, позволяющая описать независимое и взаимовлияющее протекание двух реакций и объяснить полученные в настоящей работе и известные из литературы экспериментальные факты.

МАНИКАМ А., МОАН М., МРИДУЛА М., МУРАД A.M., СИВАКУМАР С., ТАЙЮМАНАВАН Б., ФРАНКО О.Л. — 2006 г.

Для клонирования генов зеиноподобных белков, накапливающихся в большом количестве в развивающихся зернах мелкого проса (Panicum sumatrense Roth.), проведена ОТ-ПЦР со специфическими праймерами. Фрагмент кДНК длиной 750 пар оснований был секвенирован, причем in silico анализ показал его высокую степень гомологии с а-проламинами. Отмечено, что в это семейство входят зеины из Zea mays, коиксины из Coix lachryma-jobi и а-кафирины из Sorghum bicolor. В результате сравнения первичных структур идентифицирован потенциальный консервативный домен зеиноподобных белков. Кроме того, последующий анализ показал, что зеиноподобный белок проса образует антипараллельную а-спиральную шпильку с разными поверхностями: гидрофобной и гидрофильной, которая, вероятно, может участвовать в агрегации запасных белков. Исследования зеиноподобных а-проламинов мелкого проса позволят клонировать кодирующие их гены и внедрить их в другие пищевые культуры с низкой пищевой ценностью, такие как хлебные злаки и бобовые.

BY X., ВАНГ М., ДУАН X., ЛИ Ф., МА Д., ХАУ Ю. — 2006 г.

Из моногибридной системы дрожжей выделены два гена EREBP: GhEREB2 и GhEREB3, имеющие по одному интрону в кодирующей области. Установлено, что последовательности аминокислот белков, кодируемых этими генами, имеют некоторые черты* типичные для факторов транскрипции: один участок, обогащенный основными аминокислотами (вероятно, сигнал ядерной локализации), один домен, обогащенный кислыми аминокислотами (возможно, домен активации транскрипции), и один консервативный ДНК-связываю-щий домен. Выявлена высокая степень гомологии последовательностей этих белков особенно в области ДНК-связывающего домена. Отмечено, что GhEREB2 экспрессируется в корнях, стеблях и нижних листьях, a GhEREB3 - только в листьях. Экспрессия GhEREB2 и GhEREB3 индуцируется этиленом и жасминовой кислотой. Кроме того, белки GhEREB2 и GhEREB3 специфически связываются с GCC-боксом и активируют экспрессию репортерных генов HIS3 и LacZ в дрожжах. Все это свидетельствует о том, что гены GhEREB2 и GhEREB3 в качестве позитивного фактора транскрипции могут участвовать в биотической сигнальной системе стрессовой трансдукции.

ИВАХНО С., КОРНЕЛЮК А. — 2006 г.

В статье рассматривается текущее состояние исследований в быстро растущей области количественной протеомики и ее применения в системной биологии. Методы мечения стабильными изотопами в сочетании с ЖХ-разделением и тандемной масс-спектрометрией дают возможности для высокопроизводительной идентификации и относительного количественного определения белков. Используя как метаболическое, так и химическое мечение белков стабильными изотопами можно проследить с высокой точностью изменения в содержании белков. Количественная протеомика может быть успешно использована для определения изменений относительного содержания белков, обнаружения новых белок-белковых и белок-пептидных взаимодействий, исследования образования больших макромолекулярных комплексов и выявления временных изменений в белковом составе органелл, изменений фосфорилирования в сигнальных каскадах. Более того, количественная протеомика позволяет непосредственно сравнивать активацию полных сигнальных сетей в ответ на индивидуальные воздействия, и обнаруживать критические различия в цепях, ответственных за изменения клеточного ответа. Развитие протеомной биоинформатики и непрерывное усовершенствование технологий протеомики, а также геномики и транскриптомики позволяет сейчас исследовать клеточные механизмы на интегрированном системном уровне.

АКИФЬЕВ Б.Н., БУРОВ С.В., ДИЖЕ Е.Б., ЕФРЕМОВ A.M., ИГНАТОВИЧ И.А., ОРЛОВ С.В., ПЕРЕВОЗЧИКОВ А.П., ПОХВОЩЕВА А.В. — 2006 г.

Исследование посвящено изучению условий формирования комплексов ДНК с К8 и выявлению факторов, влияющих на эффективность проникновения таких комплексов в клетки млекопитающих в сравнении с комплексами ДНК с аргинин-богатым фрагментом (47-57) транскрипционного активатора ТАТ вируса иммунодефицита человека первого типа (ТАТ-пептида). Впервые детально исследована стехиометрия положительно заряженных комплексов ДНК/К8. Выявлен некооперативный характер взаимодействий ДНК- К8 при комплексообразовании. Показано, что наряду с положительным зарядом таких комплексов необходимым условием для достижения максимальной эффективности трансфекции является присутствие в среде избытков свободного, не связанного с ДНК пептида, обеспечивающего защиту комплексов ДНК/К8 от разрушения отрицательно заряженными протеогликанами клеточной поверхности. Установлено, что помимо положительного заряда защитный эффект определяется структурой пептида. В отличие от комплексов ДНК с молекулярными коныогатами на основе поли-L-лизина, агрегация комплексов ДНК/К8 увеличивает уровень экспрессии перенесенного гена.

АНТОНЕНКО Ю.Н., ЗАХАРОВ С.Д., КОТОВА Е.А., КРЕМЕР У.A., СОБКО А.А. — 2006 г.

В рамках модели тороидальной белок-липидной поры предсказано влияние ионов кальция на ионные каналы колицина Е1. В электрофизиологических экспериментах установлено, что активность каналов, образованных колицином Е1 в мембранах из дифитаноилфосфатидилглицерина, подавляется действием ионов кальция, в то время как десорбции белка с поверхности мембраны не происходит. При измерениях тока на мембране из дифитаноилфосфатидилхолина эффект кальция не наблюдается. С помощью анализа одиночных каналов установлено, что вызванное кальцием снижение индуцированного колицином тока через отрицательно заряженную мембрану обусловлено уменьшением числа открытых каналов колицина, а не изменением их свойств. Влияние ионов кальция на каналообразующую активность колицина Е1 объясняется изменением кривизны мембраны в результате электростатического взаимодействия кальция с отрицательно заряженными головками липидов.

РОГАЕВ Е.И. — 2006 г.

Малая РНК - разнообразный и широко распространенный тип некодирующей РНК мозга. Функции большинства таких РНК неизвестны. Специфический класс малых РНК, микроРНК, динамически регулируется в нейрогенезе и в процессе развития мозга эмбриона. Согласно предсказаниям с использованием ряда компьютерных алгоритмов, гены, ответственные за формирование синапсов и за некоторые формы умственной отсталости, являются предположительными мишенями для микроРНК. Молекулярный патогенез многих болезней психического развития, аутизма, шизофрении и аффективных расстройств до сих пор остается неясным. Предлагается гипотеза о роли малой регуляторной РНК, и в частности микроРНК, в патогенезе заболеваний мозга, особенно связанных с формированием центральной нервной системы в развитии. Первичные эксперименты с использованием чип-набора генов микроРНК показали, что микроРНК, выделенные из постмортального человеческого мозга, пригодны для получения профиля экспрессии микроРНК мозга. Обширная экспрессия генов микроРНК в человеческом мозге и их регуляторная роль предполагают использование конвергентного подхода: функционального анализа микроРНК в моделях нейронов, а также анализа генетических вариаций и профиля экспрессии микроРНК в норме и нейропси-хических патологиях.

БРАТКОВСКАЯ И., ИВАНЕЦ Р., КУЛИС Ю. — 2006 г.

Исследована кинетика реакций окисления 4-гидроксибифенила (4-ГБФ), катализируемого лакказой из Polyporus pinsitus в присутствии метилсирингата (МС), действующего в качестве электронно-транспортного медиатора. Измерения проведены в 0,05 М ацетатном буферном растворе, рН 5,5, в присутствии 4-ГБФ, метилсирингата и лакказы. Экспериментально показано, что скорость окисления малоактивного субстрата (4-ГБФ) значительно увеличивается в процессе синергетического действия высокоактивного субстрата (метилсирингата). Рассчитаны бимолекулярные кинетические константы скоростей взаимодействия окисленной формы лакказы с МС, окисленной формы лакказы с 4-ГБФ и окисленной формы МС с 4-ГБФ. Предложена кинетическая схема синергетического действия субстратов, на основании которой была получена зависимость начальной скорости от концентрации компонентов реакции. В результате анализа экспериментальных данных получены кинетические константы, близкие к полученным в процессе математического моделирования.

ДУДИНЬСКА В., СКОТНИЦКА Е., СУСКА М., ХЛЫНЧАК А.Й. — 2006 г.

В обзоре суммируется современная информация о ключевой части метаболизма эритроцитов, а именно о превращениях пуринов и их связи с другими путями превращений. Описаны клеточный ресинтез, взаимо превращения и деградация пуриновых соединений, а также механизм регуляции этих путей превращения. Мы также коснулись нарушений метаболизма пуринов и их клинических последствий. Поскольку исследо вания сконцентрированы только на отдельных аспектах метаболизма пуринов, а в литературе представлены фрагментарные данные, очевидна необходимость синтетического подхода.

БРУСНИЧКИН А.В., ВЛАДИМИРОВ Ю.A., ИЗМАЙЛОВ Д.Ю., КАГАН В.Е., НОВИКОВ А.А., ОСИПОВ А.Н., ПРОСКУРНИНА Е.В. — 2006 г.

В данной работе сопоставлено влияние кардиолипина из сердца быка, синтетического тетраолеилкардио- липина (ТОКЛ) и неспецифического анионного детергента додецилсульфата натрия на пероксидазную ак- тивность цитохрома с, регистрируемую по хемилюминесценции в присутствии люминола, и на связь, Fe...S(Met80), наличие которой оценивалось по амплитуде слабой полосы поглощения с максимумом при 695-700 нм (А695). Показано, что при молярных соотношениях кардиолипин: цитохром с и додецилсульфат : цитохром с от 0 : 1 до 50 : 1 наблюдается строгий количественный параллелизм между разрывом связи Fe...S(Met80) (A69i) и ростом пероксидазной активности цитохрома (по хемилюминесценции). Отмечено, что пероксидазная активность цитохрома с при полном исчезновении полосы A69i была в случае кардиолипина более чем в 20 раз выше, чем при действии додецилсульфата, а при низких молярных соотношениях лиганд : белок (<4) додецилсульфат вообще не активировал пероксидазную активность, тогда как кардио- липин усиливал пероксидазную активность цитохрома с в 16-20 раз. Установлено, что при связывании ци- тохрома с с липосомами, состоящими из ТОКЛ и фосфатидилхолина (1: 10 : 10), изменения Ам$ не происходило, тогда как пероксидазная активность увеличивалась в 8 раз. При этом разрушение связи Fe...S(Met80) на 70% приводило всего к трехкратному возрастанию пероксидазной активности. Обнаружено, что активированная кардиолипином пероксидазная активность цитохрома с снижалась при высокой ионной силе раствора (1 М КС1). Таким образом, активирующее действие кардиолипина вызвано, во-первых, неспецифическим эффектом разрыва связи Fe...S(Met80) в результате конформационного изменения глобулы бел- ка при электростатической перезарядке его поверхности анионной амфифильной молекулой, а во-вторых, специфическим ускорением реакции пероксидации, которое, по всей видимости, обусловлено увеличением доступности гема для Н202 в результате гидрофобного взаимодействия кардиолипина с цитохромом.

ВИНТЕР В.Г., КОНОВАЛОВА О.А., НЕВЗОРОВА Т.А., САЛАХОВ М.Х. — 2006 г.

Из сыворотки крови больных системной красной волчанкой получено четыре фракции антител к нативной ДНК класса IgG, проявляющих различное сродство к ДНК-целлюлозе, обладающих термостабильной ДНК-гидролизующей активностью и различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе. Отмечено, что ДНК-гидролизующие антитела к нативной ДНК являются металлозависимыми эндонуклеазами, осуществляют в ДНК преимущественно одноцепочечные разрывы и проявляют активность в широком диапазоне значений рН. Методом атомно-силовой микроскопии получены трехмерные изображения комплексов ДНК-ДНК-гидролизующее антитело к нативной ДНК с нанометровым разрешением и доказано, что для ДНКазной активности антител к нативной ДНК характерен непроцессивный механизм действия.

ЗЕМЛЯНСКИХ Н.Г., КОФАНОВА О.А. — 2006 г.

Проведена оценка изменений активности Са 2+-АТРазы эритроцитов человека под влиянием эндоцеллюлярного криопротектора глицерола и анализ возможности участия кальмодулина в регуляции функций Са-насоса в данных условиях. Для изучения модификации Са 2+-АТРазы использовали модельные системы сапонин-пермеабилизированных клеток и изолированных фракций мембран (белых теней) эритроцитов. На модели сапонин-пермеабилизированных клеток было показано, что небольшие концентрации глицерола стимулируют ферментативную активность Са-насоса, достигая максимального эффекта при 10%-ном содержании криопротектора в среде. Увеличение концентрации глицерола свыше 20% ведет к торможению Са 2+-АТРазной активности Отсутствие стимулирующего эффекта глицерола на Са 2+-АТРазу в белых тенях может быть связано с удалением эндогенных регуляторов, контролирующих функциональную активность данной ионтранспортирующей системы. Анализ с использованием ингибитора кальмодулин-зависимых реакций R24571 показал, что активация Са 2+-АТРазы 10%-ным глицеролом отмечалась в случае, если ингибитор вводили в суспензию после модификации клеток криопротектором и исчезала, если его добавляли до контакта эритроцитов с глицеролом. Полученные данные предполагают возможность регуляции активности Са 2+-АТРазы эритроцитов человека под воздействием глицерола как вследствие структурных изменений в мембране, вызванных эффектами раствора, так и в результате включения эндогенного модулятора кальмодулина в модификацию каталитической активности Са-насоса.

ЕВЛАКОВ К.И., ИВАНОВСКАЯ М.Г., ЛОМАКИН А.Ю., РЫБАЛКИНА Е.Ю., СЕРДЮК И.Н., ТИМЧЕНКО М.А. — 2006 г.

Изучено ковалентное связывание синтетического фрагмента ДНК с эукариотическим фактором транскрипции NF-kB в лизатах клеток карциномы кишки человека НСТ-116. Для связывания использовали 32Р-меченный 17/19-звенный ДНК-дуплекс, содержавший участок узнавания NF-kB (кВ-участок), в котором одна из межнуклеотидных фосфатных групп заменена на химически активную тризамещенную пирофос-фатную группировку (ТЗПГ). Методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях (по Лэммли) с последующим иммуноблоттингом установлено, что 32Р-меченный ДНК-дуплекс селективно и необратимо связывается с NF-kB в лизатах опухолевых клеток в присутствии остальных компонентов клетки. Проведенные испытания по доставке этого ДНК-дуплекса, содержавшего на З'-конце модифицированной цепи остаток родамина, в опухолевые клетки НСТ-116 показали, что родаминмеченная ДНК проникает через клеточную мембрану без дополнительных систем доставки. С применением метода флуоресцентной микроскопии установлено, что родаминмеченная ДНК первоначально локализуется в цитоплазме. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии обнаружено, что при последующей обработке клеток TNF-a ДНК-реагент частично транслоцируется в ядро.

ГОРБАЧЕВА Л.Р., ИШИВАТА С., ПИНЕЛИС В.Г., СТОРОЖЕВЫХ Т.П., СТРУКОВА С.М. — 2006 г.

Исследовано влияние тромбина, фактора Ха (FXa) свертывания крови и пептидов-агонистов рецепторов 1 и 2, активируемых протеиназами (PARI-АР и PAR2-AP), на выживаемость культивируемых гиппокампаль-ных нейронов крысы и внутриклеточный кальциевый гомеостаз при глутаматной цитотоксичности. Тромбин и FXa в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 нМ существенно снижали гибель нейронов после действия глутамата. Инактивация ферментов отменяла их протекторное действие. С помощью агонистов (PAR1-AP и PAR2-AP) и антагониста PARI показано, что нейропротекторное действие тромбина на нейроны реализуется через активацию PARI, a FXa - через новый подтип рецепторов PAR. Установлено, что тромбин, в отличие от FXa, вызывает в гиппокампальных нейронах транзиторный кальциевый ответ, который опосредуется, главным образом, 1Р3-рецепторами эндоплазматического ретикулума. Обе сериновые протеиназы стимулируют восстановление кальциевого гомеостаза гиппокампальных нейронов в постглутаматный период.

ВЛАСОВА М.A., МОШКОВСКИЙ С.A. — 2006 г.

Сывороточный амилоид А острой фазы (A-SAA) представляет собой известный маркер воспаления. В нас- тоящем обзоре суммированы данные о регуляции экспрессии A-SAA, сигнальных путях, в которые он вов- лечен, оказываемых им воздействиях и их возможном влиянии на прогрессию злокачественных опухолей.