научный журнал по химии Биохимия ISSN: 0320-9725

КИСЕЛЕВСКИЙ Д.Б., ЛАГУНОВА Е.М., НЕСОВ А.В., САМУИЛОВ B.Д., СИНИЦЫН С.В., ШЕСТАК А.А. — 2006 г.

Добавление Н2О2 усиливало СN~-индуцированный апоптоз замыкающих клеток устьиц (УК) и в меньшей степени апоптоз основных эпидермальных клеток (ЭК) в пленках нижнего эпидермиса, изолированных из листьев гороха. Максимальное действие Н2О2 на УК проявлялось при концентрации 100 мкМ. Включая нециклический перенос электронов в хлоропластах, менадион и метилвиологен усиливали образование Н2О2 на свету, но предотвращали СN~-индуцированный апоптоз УК. Световая стимуляция действия CN" на апоптоз УК не может быть обусловлена нарушением функции рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы и вызванной этим генерацией ОН' в хлоропластах с участием свободных металлов с переменной валентностью в реакциях типа Фентоновской или Хабера-Вейсса, а также с участием FeS-центров электронак-цепторной ветви фотосистемы I. Менадион и метилвиологен не подавляли СN-индуцированный апоптоз ЭК, которые, в отличие от УК, содержат митохондрии и не содержат хлоропласты. Хинакрин и дифениле-ниодоний, известные как ингибиторы NАD(Р)Н-оксидазы плазматической мембраны клеток, в испытанных концентрациях не влияли на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 высечками листьев, но предотвращали СN-индуцированную гибель УК. Данные позволяют предполагать, что NАD(Р)Н-оксидаза плазматической мембраны УК является источником активных форм кислорода (АФК) для реализации СN-индуцированной клеточной смерти (ПКС). Хлоропласты и митохондрии не эффективны как источники АФК в программируемой гибели УК. Если АФК образуются в недостаточной степени, стимулирующим действием на ПКС обладает добавленный Н2О2. Н2О2 снижал ингибирующее действие DCMU и DNP-INT на СN-индуцированный апоптоз УК. Хинакрин, DCMU и DNP-INT не влияли на CN'-индуцирован-ную гибель ЭК.

ВОНГ К.К., ЖУ К.Л., ЛИАНГ Л.К., ШИ З.М. — 2006 г.

Получение мугантного штамма Al 1 с высоким содержанием трегалозы из Saccharomycopsis fibuligera sdu бы ло описано ранее. В данной работе исследовано накопление трегалозы клетками S. fibuligera A11 при различ ных стрессовых воздействиях. В условиях стресса не было выявлено ни активации трегалозофосфатсинта- зы (SfTpsl), ни изменения содержания трегалозы. Фрагмент гена Sftps1 был клонирован при помощи поли- меразной цепной реакции (ПЦР) с использованием метода CoDeHOP и множественного выравнивания последовательностей Tps1. Данный подход позволил исследовать экспрессию гена Sftps1, которая также ос тавалась на постоянном уровне в стрессовых условиях. Таким образом, метаболизм трегалозы в клетках S. fibuligera A11 отличается от метаболизма трегалозы в S. cerevisiae и большинства других грибов, так как в пер вом случае экспрессия гена Sftps1 не является ответом на стрессовые условия.

КУЛАЕВ И.С., КУЛАКОВСКАЯ Т.В., ЛИЧКО Л.П. — 2006 г.

Известно, что цитозоль, ядра, вакуоли и митохондрии дрожжей Saccharomyces cerevisiae содержат неорганические полифосфаты (полиР), а количество полиР, спектры длин цепей и их зависимость от фазы роста различны в указанных компартментах. Установлено, что инактивация гена РРХ1 не влияет на метаболизм по-лиР при культивировании дрожжей в среде с глюкозой и 5-7 мМ Рi, а инактивация гена PPN1 приводит к исчезновению высокомолекулярных экзополифосфатаз (120-830 кДа) из цитозоля, ядер, вакуолей и митохондрий S. cerevisiae. По-видимому, именно PPN1 кодирует эти ферменты. Обнаружено, что при инактивации PPN1 уменьшается экспрессия низкомолекулярной экзополифосфатазы (~45 кДа), кодируемой геном РРХ1. Отмечено, что инактивация PPN1 мало изменяет общее содержание полиР, однако приводит к увеличению содержания длинноцепочечных полиР во всех исследованных компартментах.

ДЕМИДЮК И.В., КОСТРОВ С.В., ЛИХАРЕВА В.В., ЛУБЕНЕЦ Н.Л., МИХАЙЛОВА А.Г., РУМШ Л.Д., ХАЙРУЛЛИН Р.Ф. — 2006 г.

Разработан препаративный метод очистки новой протеиназы из психрофильного грамотрицательного микроорганизма Serratia proteamaculans (PSP) с помощью аффинной хроматографии на BPTI-сефарозе. Получен гомогенный по данным электрофореза препарат протеиназы с молекулярной массой 60 кДа. Показано, что по своим свойствам (температурная и рН-стабильность, высокая каталитическая эффективность) исследуемый фермент является психрофильным. С помощью ингибиторного анализа и исследования субстратной специфичности показано, что PSP - трипсиноподобная сериновая и одновременно Zn-зави-симая протеиназа.

АТАБЕКОВ И.Г., ДОРОХОВ Ю.Л., ЗВЕРЕВА А.С., КОМАРОВА Т.В., СКУЛАЧЕВ М.В., ШВАРЦ А.М. — 2006 г.

На основе генома Х-вируса картофеля (ХВК) сконструирован вектор (ХВК-репликон) для суперпродукции целевых белков в растениях. Геном ХВК-вектора содержит ген зеленого флуоресцентного белка медузы вместо делетированных тройного блока генов транспорта и гена белка оболочки. Возможность столь значительного сокращения размеров вектора-репликона обусловлена высокой эффективностью трансфекции листьев растения с применением технологии агроинъекции (инъекция клеток Agrobacterium tumеfaciens, содержащих ХВК-вектор в составе бинарного вектора). Новый вектор-репликон может быть применен для суперпродукции в растениях различных целевых (в том числе терапевтических) белков.

ПЧЕЛИНЦЕВ Н.А., ШВЯДАС В.К., ЮШКО М.И. — 2006 г.

Предложен метод непрерывной регистрации протекания ферментативных реакций, катализируемых иммо-билизованным ферментом - поперечно сшитыми агрегатами пенициллинацилазы. Подобраны подходя-щие хромогенные субстраты для спектрофотометрического слежения за каталитической активностью иммобилизованного фермента и определены кинетические параметры их превращения. С использованием разработанного метода проведено титрование активных центров в препарате поперечно сшитых агрегатов ПА и показано, что практически все активные центры фермента сохраняются при иммобилизации. Отмечено, что разработанный метод отличается высокой экспрессностью, точностью и простотой и может быть использован как для контроля эффективности процесса иммобилизации ПА, так и для изучения операци-онной; температурной и рН-стабильности препаратов иммобилизованного фермента.

ВАСИЛЬЕВ В.Б., ЗАХАРОВА Е.Т., КОЛОДКИН Н.И., ПУЛИНА М.О., РУНОВА О.Л., СОКОЛОВ А.В., СУСОРОВА А.С. — 2006 г.

Впервые доказано существование в грудном молоке (ГМ) комплекса медьпротеида-церулоплазмина (ЦП, ферро-02-оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1) и лактоферрина (ЛФ). Электрофоретическая подвижность ЦП в ГМ при ПААГ-электрофорезе в неденатурирующих условиях меньше, чем у ЦП из плазмы крови, и идентична подвижности комплекса, образующегося при смешивании очищенных препаратов ЦП и ЛФ. При аффинной хроматографии делипидированного ГМ на ЦП-сефарозе сорбировался ЛФ. В элюате 0,3 М NaCl с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза выявлена единственная 78 кДа зона, которая иммунологически и по определению N-концевой аминокислотной последовательности соответствует ЛФ. Синтетические пептиды R-R-R-R (N-концевой пептид ЛФ (2-5)) и K-R-Y-K-Q-R-V-K-N-K (С-концевой пептид РАСАР 38 (29-38)) эффективно элюировали ЛФ с ЦП-сефарозы. Хроматографические смолы, применяемые для выделения ЦП (АЕ-Агароза) и ЛФ (СМ-Сефадекс), не сорбируют комплекс ЦП-ЛФ из снятого ГМ. Анионные пептиды ЦП (586-597), (721-734) и (905-914) эффективно элюировали ЦП с АЕ-Агарозы, но не диссоциировали комплекс ЦП-ЛФ. При добавлении к ГМ, пропущенному через СМ-Сефадекс, антител к ЛФ вместе с ЛФ коиммунопреципитировал ЦП. Выделение комплекса ЦП-ЛФ из ГМ включало хроматографию на СМ-Сефадексе, спиртовое осаждение и аффинную хроматографию на АЕ-Агарозе, что позволило добиться чистоты комплекса 98%. Полученный комплекс ЦП-ЛФ (1:1) был разделен на компоненты при хроматографии на гепарин-сефарозе. При ограниченном триптическом гидролизе препаратов ЦП из ГМ и плазмы крови выявлены идентичные протеолитические фрагменты.

БЕРРИОЗ М., ВАСЮНИНА Е.A., ЖАРКОВ Д.О., КЕМЕЛЕВА Е.A., КОЛОСОВА Н.Г., КОНЛОН К.А., НЕВИНСКИЙ Г.A., СИНИЦИНА О.И. — 2006 г.

Разработана методика иммунофлуоресцентного анализа относительного содержания 8-оксогуанина (8-. oxoG) в ДНК. Проведен сравнительный анализ содержания 8-oxoG в ДНК из печени и легких крыс линии Wistar и преждевременно стареющих крыс линии OXYS в возрасте 2-х и 18-ти месяцев. Показано, что у крыс обеих линий содержание 8-oxoG в ДНК легких в 2 месяца в 1,7-2,0, а в 18 месяцев - в 1,3-1,7 больше, чем в печени. При этом степень окислительных повреждений в ДНК печени двухмесячных крыс OXYS в 2,4 ра- за (p < 0,01), а в ДНКпечени 18-месячных-в 1,5 раз (р < 0,05) выше, чем у крыс линии Wistar. В легких крыс линии OXYS окисление гуанина ДНК в возрасте двух месяцев в 2 (р < 0,01), а в возрасте 18-ти месяцев - в 1,7 раз (р < 0,05) выше, чем у крыс линии Wistar. Полученные данные свидетельствуют о том, что повышенный уровень окислительных повреждений ДНК в клетках различных органов крыс линии OXYS может быть важным фактором ускоренного старения и развития у них заболеваний пожилого возраста - катаракты, ма- кулодистрофии, гипертонии, остеопороза, нарушений в когнитивной и эмоциональной сфере, а также на рушений функций легких и печени.

АРНХОЛЬД Ю., ПАНАСЕНКО О.М., ШИЛЛЕР Ю., ШПАЛЬТЕХОЛЬЦ Г. — 2006 г.

Методом масс-спектрометрии MALDI-TOF показано, что лейкоцитарная миелопероксидаза (МПО) в присутствии своих субстратов (Н202 и Вг) не способна модифицировать насыщенный 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин в составе липосом. При инкубации липосом из мононенасыщенного фосфатидил-холина (1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина) в качестве основного продукта были зареги-' стрированы бромгидрины. Отмечено, что после инкубации липосом из полиненасыщенного фосфатидил- холина (1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолина) в присутствии МПО + Н202 + Вг-сис-темы основным продуктом был 1-пальмитоил-2-гидрокси-5л-глицеро-3-фосфохолин (лизофосфатидилхо-лин). Обнаружено, что если в среде инкубации отсутствовал фермент или один из его субстратов (Н202 или Вг), а также если был добавлен ингибитор МПО (азид натрия) или перехватчики гипобромита (таурин или метионин), то ни бромгидрины, ни лизофосфолипиды не образовывались. Полученные результаты позволяют заключить, что синтез как бромгидринов, так и лизофосфолипидов в присутствии МПО + Н202+ Вг~-системы является результатом взаимодействия с ненасыщенными фосфатидилхолинами НОВг/ОВг-, образующегося при МПО-катализе. Подобная модификация ненасыщенных липидов мембранных структур и липопротеинов возможна in vivo в очагах воспалительных процессов.

ПАВЛОВА Э.Л., САВОВ В.М. — 2006 г.

Целью настоящего исследования было измерение in vitro констант ингибирования антиоксидантов: аскорбиновой кислоты и мочевой кислоты в моче, методом усиленной люцигенином хемилюминесценции (ХЛ) в системе Фентона. Максимальную хемилюминесценции регистрировали в моче, содержавшей H 2O 2 (5 • 10 -4 М), Fe 2+ (5 • 10 -5 М), EDTA (5 • 10 -5 M) и химический усилитель хемилюминесценции люцигенин (10 -4 M) при рН 5,5 и 36°. Аскорбиновая кислота проявляла в 4 раза более сильный антиоксидантный эффект, чем мочевая кислота. Константы антиоксидантного ингибирования для кислот, добавленных в концентрации 10 -3 M и 10 -4 M были равны: для аскорбиновой — 5,92 ± 0,04 мкмоль • сек -1 и 24,05 ± 1,82 мкмоль • сек -1 соответственно, а для мочевой — 1,60 ± 0,02 мкмоль • сек -1 и 21,45 ± 0,97 мкмоль • сек -1 соответственно. В кинетике хемилюминесценции мочи наблюдалось три фазы: спонтанная ХЛ (0-10 с), быстрая вспышка ХЛ (10-50 с) и скрытый период (50-300 с). Обсуждается антиоксидантная эффективность аскорбиновой и мочевой кислоты на последнем этапе катаболических процессов в организме.

ГОРБАЧ В.И., ДАВЫДОВА В.Н., ЕРМАК И.М., НАБЕРЕЖНЫХ Г.А., СОЛОВЬЕВА Т.Ф. — 2006 г.

Изучено взаимодействие эндотоксинов-липополисахаридов (ЛПС) различной степени полимеризации Оспецифической цепи - с хитозаном с молекулярными массами 20 и 130 кДа с использованием конкурент- ного связывания ЛПС с комплексом хитозан-анионный краситель (тропеолин 000-2) и прямого связывания меченого [125I]-ЛПС с хитозаном, иммобилизованным на сефарозе 4В. Показано, что хитозан с молекулярной массой 20 кДа взаимодействует с ЛПС некооперативно, а иммобилизация поликатиона на сефарозе приводит к его связыванию с [125I]-ЛПС с положительной кооперативностью. При взаимодействии ЛПС' с длинной О-специфической цепью с хитозаном с молекулярной массой 130 кДа отмечена отрицательная кооперативность. Определены константы связывания ЛПС с поликатионом и число мест связывания в рас. чете на одну аминогруппу хитозана. Показано, что на аффинность взаимодействия и стехиометрию комплексов ЛПС-хитозан значительное влияние оказывают структура ЛПС и его концентрация в реакционной смеси. Увеличение длины углеводных цепей ЛПС приводит к увеличению значений констант связывания и уменьшению количества связанного эндотоксина.

АНДРИАНОВ А.М., ВЕРЕСОВ В.Г. — 2006 г.

С использованием опубликованных данных спектроскопии ЯМР методами компьютерного моделирования построены трехмерные структуры петли V3 белка gp120 HIV-1 в вирусных штаммах HIV-Haiti и HIV-MN. В обоих случаях определены элементы вторичной структуры и конформации нерегулярных участков фрагмента, образующего основную антигенную детерминанту вируса, а также детерминанты клеточного тропизма и образования синцития. Показано, что, несмотря на высокую вариабельность аминокислотной последовательности белка gp120, более 50% остатков петли V3 сохраняют конформации в различающихся вирионах HIV-1. Путем совместного анализа полученных результатов и опубликованных данных о биологической активности индивидуальных остатков петли V3 HIV-1 идентифицированы ее структурно-консервативные аминокислоты, представляющие собой перспективные «мишени» для дизайна противовирусных препаратов методами белковой инженерии.

ВАСИЛЬЕВ В.И., ГВОЗДЕВ Р.И., ПОПОВ В.О., ТИХОНОВА Т.В., ТУХВАТУЛЛШ И.А. — 2006 г.

Выделен и очищен до гомогенного состояния гидроксилазный компонент мембраносвязанной метанмоно-оксигеназы из метилотрофных бактерий Methylococcus capsulatus штамм М. Молекула белка состоит из трех субъединиц с молекулярными массами 47, 26 и 23 кДа и содержит три атома меди и один атом железа. В растворе белок существует в виде гексамера (аВу)6с молекулярной массой 660 кДа. Масс-спектрометрия показала высокую степень гомологии полученного белка с ранее описанной в литературе мембранной метан-монооксигеназой из бактерии М. capsulatus штамм Bath. Проведен первичный скрининг условий кристаллизации.

ГОЛОВЛЕВА Л.А., СОЛЯНИКОВА И.П., СУВОРОВА М.М. — 2006 г.

Работа посвящена изучению разложения napa-толуиловой кислоты штаммом Rhodococcus opacus l cp. Определена активность ключевых ферментов этого процесса - пирокатехин- 1,2-диоксигеказ и муконатциклои-зомеразы. Обнаружено, что рост на n-толуате сопровождается индукцией двух пирокатехин-1,2-диоксиге-наз. Один из ферментов по субстратной специфичности и физико-химическим характеристикам идентичен хлорпирокатехин-1,2-диоксигеназе, индуцируемой при росте R. opacus lcp на 4-хлорфеноле. Вторая из диоксигеназ, выделенная из n-толуатной биомассы, расщепляет хлорированные субстраты с незначительной, по сравнению с пирокатехином, скоростью. Однако этот фермент не идентичен пирокатехин-1,2-диокси-геназе, клонированной в составе оперона катаболизма бензоата у данного штамма, что служит подтверждением гипотезы о множественных формах диоксигеназ как адаптивной реакции микроорганизмов в ответ на стрессовое воздействие окружающей среды.

АЛИВЕРДИЕВА Д.A., ЛАГУТИНА Л.С., МАМАЕВ Д.В., ШОЛЬЦ К.Ф. — 2006 г.

Установлено, что при инкубации клеток Saccharomyces cerevisiae в аэробных условиях при 0° в отсутствие экзогенных субстратов скорость эндогенного дыхания клеток, измеренная при 30°, экспоненциально снижается с полупериодом ~5 ч. Косвенным методом показано снижение при этом содержания оксалоацетата в митохондриях in situ. Отмечено, что исходная концентрация оксалоацетата вызывает значительное подавление активности сукцинатдегидрогеназы. Снижается также скорость дыхания клеток на ацетате и других экзогенных субстратах, продуцирующих ацетил-СоА в митохондриях, и повышается скорость дыхания на сук-цинате. Эти изменения сопровождаются повышением концентрации L-малата в клетках по крайней мере в 3 раза за 24 ч. Предполагается, что увеличение концентрации L-малата в клетках и одновременное снижение концентрации оксалоацетата в митохондриях связано с замедлением транспорта субстратов эндогенного дыхания из цитозоля в митохондрии при 0°. Это замедление может быть обусловлено высокой энергией активации Аррениуса, характерной для транспортеров. Обсуждается физиологическое значение L-малата в регуляции дыхания клеток S. cerevisiae.

ЕРМАКОВ И.П., МАТВЕЕВА Н.П., МЕЙЧИК Н.Р., НИКОЛАЕВА Ю.И., ЧАЙКОВА А.В. — 2006 г.

Исследовали состав ионогенных групп и ионообменную способность полимерного матрикса клеточных стенок, которые были выделены из пыльцевого зерна и тканей вегетативных органов (листья и стебли) Lilium longiflorum Thumb. Ионообменная способность оценена при разных значениях рН и при ионной силе раствора, равной 100мМ. Получены данные о существовании в структуре двухслойной оболочки пыльцевого зерна и стенках соматических клеток четырех типов ионогенных групп: аминных, двух карбоксильных, первая из которых является остатком уроновых кислот, а вторая — оксикоричных, и фенольных. Установлено, что в интине представлены все четыре типа групп, а в экзине, — наряду с анионообменной группой, лишь две катионообменные. Определено количество групп каждого типа и константы их ионизации. Показано, что количественный и качественный состав структурных полимеров интины пыльцевого зерна и клеточных стенок соматических клеток лилии значительно различается. Авторы предполагают, что в интине, как и в первичных стенках соматических клеток, оксикоричные кислоты участвуют в образовании поперечных связей между цепями полисахаридов, и что такие сшивки играют ключевую роль в структурной организации и структурной целостности оболочки пыльцевого зерна.

АСТАХОВА Т.М., БОНДАРЕВА Л.A., ДМИТРИЕВА С.Б., ЕРОХОВ П.А., ШАРОВА Н.П. — 2006 г.

Изучены изменение удельной активности и количества пулов 26S- и 20S-npoTeacoM в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии, а также динамика появления в них иммунных субъединиц. Показано, что химотрипсиноподобная активность всех исследованных пулов протеасом падает дважды в течение первых трех недель после рождения. Минимальная активность в эти периоды приходится на 11-е и 19-е сутки, причем первый из них длится дольше и характеризуется более значительным уменьшением активности по сравнению со вторым. Отмечено, что падение удельной активности пулов 26S-протеасом сопровождается уменьшением их количества. Для пулов 20!5-протеасом подобной закономерности не обнаружено. Иммунные субъединицы LMP7 и LMP2 выявляются с помощью Вестерн-блоттинга в заметных количествах в селезенке на 7-е сутки, а в печени на 19-е сутки, что совпадает по времени с началом падения активности протеасом. Сделан вывод, что в течение первых трех недель постнатального развития в селезенке и печени крысы дважды происходит смена пулов протеасом, причем в селезенке формируется качественно новый пул, содержащий иммунные субъединицы, почти на две недели раньше, чем в печени. Появление иммунных протеасом в различных органах в течение нескольких недель после рождения может объяснить причину неэффективного функционирования иммунной системы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии.

ЛИХТЕНШТЕЙН А.В. — 2006 г.

БРЮХАНОВ А.Л., НЕСАТЫЙ В.И., НЕТРУСОВ А.И. — 2006 г.

Супероксидцисмутаза (СОД) метаногенной археи Methanobrevibacter arboriphilus штамм AZ, являющейся строжайшим анаэробом, была очищена в четыре стадии до удельной активности 3970 ед/мг белка с выходом 22%. Показано, что СОД М, arboriphilus является Fe-содержащим гомотетрамером с молекулярной мас- сой субъединицы 21,2 кДа. Азид натрия (13,5 мМ), в отличие от цианида калия, ингибирует, а пероксид водорода (0,5 мМ) инактивирует фермент, что указывает на его сходство с известными Fe-содержащими СОД из метаногенных архей.

ГАЙДА Г.З., ГОНЧАР М.В., МОРОЗОВА О.В., НИКИТИНА О.В., ПАВЛИШКО Т.Н., ШЛЕЕВ С.В., ШУМАКОВИЧ Т.П. — 2006 г.

Алкогольоксидаза (АО) была восьмикратно очищена из штамма-сверхпродуцента Hansenula polymorpha С-105 (gcrl catX), полученного генетическим конструированием из метилотрофных дрожжей. Этот штамм обладает ослабленной глюкозной катаболитной репрессией и полностью лишен каталазы. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле и ЖХВД установлено, что конечный препарат фермента был гомогенным. Изучены некоторые физико-химические и биохимические характеристики АО: молекулярная масса (~620 кДа), изоэлектрическая точка (6,1), спектральные свойства (спектры поглощения, кругового дихроизма и флуоресценции). Содержание различных мотивов вторичной структуры фермента было вычислено по данным КД-спектров с использованием компьютерной программы «КД-белок». Показано, что нативный фермент содержит ~50% а-спиралей, 25% B-слоев наряду с 20% беспорядочных структур. Кинетические измерения при определении каталитических параметров ферментативных реакций различных субстратов, таких как метанол, этанол и формальдегид, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Установлено, что скорость ферментативного окисления формальдегида алкогольоксидазой из H. polymorpha всего лишь в 2 раза ниже, чем скорость окисления лучшего субстрата АО - метанола.