научный журнал по химии Прикладная биохимия и микробиология ISSN: 0555-1099

АВЕТИСОВА Г.Е., АМБАРЦУМЯН А.А., МЕЛКОНЯН Л.О., САГИЯН А.С., ЧАХАЛЯН А.Х. — 2013 г.

Изучены механизмы сверхсинтеза L-аланина у штаммов-продуцентов Brevibacterium flavum. Показано, что -Cl-L-аланин является ингибитором ключевых ферментов синтеза L-аланина – аланин-трансаминазы и валин:пируват-трансаминазы. У родительского штамма-продуцента B. flavum AA5 со сниженной активностью аланинрацемазы (98) получены устойчивые к -Cl-L-аланину высокоактивные штаммы-продуценты B. flavum GL1 и GL18. Показано, что повышение уровня синтеза L-аланина у новых продуцентов является следствием снятия ингибирования аланин-трансаминазы конечным продуктом, а также дерепрессии аланин-трансаминазы и валин:пируват-трансаминазы.

БЕКЛЕМИШЕВ А.Б., ИВАНОВ И.Д., КОВАЛЕНКО Г.А., КУЗНЕЦОВ В.Л., МАМАЕВ А.Л., МОСЕЕНКОВ С.И., ПЕРМИНОВА Л.В., ЧУЕНКО Т.В. — 2013 г.

Исследованы многокомпонентные композитные биокатализаторы с липолитической активностью, приготовленные путем включения клеток рекомбинантного штамма-продуцента термостабильной липазы из Thermomyces lanuginosus в SiO2-ксерогеле, содержащем наноуглеродный компонент – многослойные углеродные нанотрубки разного диаметра, а также углеродные наносферы луковичной структуры. Изучены свойства липазы как в клеточных суспензиях рекомбинантного штамма-продуцента, сконструированного на основе E. сoli BL21(DE3), так и в иммобилизованном состоянии в зависимости от структуры и дисперсности наноуглеродного компонента, вводимого в состав биокатализаторов. Показано, что рекомбинантная внутриклеточная липаза проявляла активность в реакции гидролиза трибутирина, равную в среднем 50 Е/мг сухих клеток, и обладала высокой термостабильностью. При прогревании в оливковом масле при 100°С константа инактивации и время полуинактивации составили, соответственно, 6?10-3 мин-1 и 2 ч, что на порядок превышает термостабильность липазы в буфере. Биокатализаторы с введенными в их состав агрегированными “толстыми” нанотрубками диаметром 20–22 нм проявляли максимальную начальную активность – 250 Е/г.

БУРКИН А.А., КОНОНЕНКО Г.П., ТОЛПЫШЕВА Т.Ю. — 2013 г.

Разработан метод иммуноферментного анализа усниновой кислоты в лишайниках с чувствительностью 0.1 мкг/г воздушно-сухого материала (0.00001%). Поликлональные кроличьи антитела к бычьему сывороточному альбумину, конъюгированному с (+)-усниновой кислотой в условиях формальдегидной конденсации, при взаимодействии с гомологичным по способу связывания иммобилизованным конъюгатом с желатином позволяли определять анализируемое вещество в растворах с концентрацией от 1 нг/мл. Усниновая кислота найдена во всех 236 исследованных образцах лишайников, относящихся к 53 видам и 8 семействам, в количествах 2–26600 мкг/г (0.0002–2.6%).

АЛЕБЯН Г.П., АМБАРЦУМЯН А.А., ДАДАЯН С.А., ПАЛОЯН А.М., САГИЯН А.С., СТЕПАНЯН Л.А. — 2013 г.

Рассчитаны Кm для L-фенилаланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты и соответствующих кетокислот, а также Vmax для пар субстратов: L-фенилаланин – 2-кетоглутарат, L-фенилаланин – оксалоацетат, L-глутаминовая кислота – фенилпируват и L-аспарагиновая кислота – фенилпируват для аминотрансфераз PAT1, PAT2 и PAT3 Erwinia carotovora subsp. carotovora ИНМИА № 8724, катализирующих переаминированиe фенилпирувата. Аминотрансфераза PAT3 ингибировалась 2-кетоглутаратом (Ks – 10.23 ± 3.20 мМ) и оксалоацетатом (Ks – 3.73 ± 1.99 мМ). Конкурентным ингибитором РАТ1 являлся L- -(N-бензиламино)аланин при использовании в качестве субстрата L-фенилаланина (KI = 0.32 ± 0.07 мM, Km = 0.45 ± 0.1 мM, Vmax = 11.6 ± 0.4 ед./мг) при концентрации 2-кетоглутарата в реакционной среде 25 мМ. L- -(N-метиламино)аланин – бесконкурентный ингибитор для PAT3 при той же паре субстратов (KI = 138.4 ± 95.4 мМ, Km = 13.7 ± 3.9 мМ, Vmax = 18.6 ± 4.1 ед./мг) и концентрации 2-кетоглутарата 2 мМ в реакционной среде. Исследованы L-стереоизомеры некоторых небелковых аналогов ароматических аминокислот в качестве субстратов для PAT1, PAT2 и PAT3.

АБДУЛИНА Д.Р., АСАУЛЕНКО Л.Г., ВОЙЧУК С.И., ИУТИНСКАЯ Г.А., ПУРИШ Л.М. — 2013 г.

Методом трансмиссионной электронной микроскопии исследованы углеводные компоненты биопленок коррозионно-агрессивных бактерий с использованием лектинов, меченных коллоидным золотом. В составе экзополимеров выявлены аминосахара – N-ацетил-D-глюкозамин, N-ацетил-D-галактозамин и нейтральные углеводы D-глюкоза и D-манноза. Установлено, что лектины с одинаковой углеводной специфичностью в разной степени взаимодействовали с углеводными компонентами биопленок бактерий. Показано, что для выявления N-ацетил-D-галактозамина в биопленке Desulfovibrio sp. 10 и Bacillus subtilis 36 наиболее специфичен лектин LBA, а для N-ацетил-D-глюкозамина в биопленке B. subtilis 36 и Pseudomonas aeruginosa 27 – WGA. Для визуализации нейтральных углеводов в исследуемых культурах наиболее специфичен лектин PSA. Доказано, что лектины, меченные коллоидным золотом, можно применять как экспресс метод для выявления и локализации углеводов в составе гликополимеров экзополимерного матрикса биопленок.

АСЕЕВА В.Г., ГРАЧЁВ В.А., ДОРОФЕЕВ А.Г., КАЗАКОВА Е.А., КЕВБРИНА М.В., КОЗЛОВ М.Н., НИКОЛАЕВ Ю.А., ПОЛЯКОВ Д.Ю. — 2013 г.

Исследован липидный состав микробного сообщества активного ила пилотного реактора, осуществляющего анаэробное окисление аммония (процесс анаммокс) на Курьяновских очистных сооружениях (г. Москва). Основная часть жирнокислотного состава (95%) представлена традиционными жирными кислотами С14 С18 как нормального, так и изостроения. В биомассе активного ила установлено наличие липидов, содержащих т.н. ладдерановые вещества (“лестничные” спирты и жирные кислоты), характерные для анаммокс-бактерий: С20-[3]-ладдерановый и С20-[5]-ладдерановый спирты, С18- и С20-[3]-ладдерановая и С18- и С20-[5]-ладдерановые кислоты. Кроме того, в нативном (негидролизованном) экстракте обнаружены простые и сложные эфиры этих веществ с остатками фосфохолина, фосфоэтаноламина, фосфоглицерина. Для некоторых соединений получены и публикуются впервые спектры электронного удара и тандемной масс-спектрометрии.

ГАЙДА Г.З., ГОНЧАР М.В., СТАСЮК Н.Е. — 2013 г.

Разработан высокоселективный и чувствительный метод количественного определения L-аргинина (Арг) с флуоресцентной детекцией продукта реакции. Метод основан на использовании аргиназы I печени человека, выделенной из рекомбинантного штамма-продуцента – дрожжей Hansenula polymorpha, и 2,3-бутандионмонооксима в качестве реагента на мочевину – продукт ферментативной реакции. Линейный диапазон концентраций определения Арг в конечной реакционной смеси – от 0.2 до 250 мкМ, предел детекции – 0.16 мкМ. Апробация нового метода на образцах коммерческих фармацевтических препаратов, содержащих Арг, продемонстрировала высокую корреляцию результатов (R = 1.0) с данными производителя и результатами других методов определения Арг.

ПАРВАНОВ П., РУСЕНОВА Н.В., СТАНИЛОВА С. — 2013 г.

Разработан быстрый и чувствительный метод мультиплексной полимеразной цепной реакции для стандартной диагностики американского гнильца. Предложен новый подход для обнаружения Paenibacillus larvae в гнилостной массе. Исследовано 45 образцов такой массы из пчелиных сот, в которых предполагалось присутствие американского гнильца. В экспериментальную выборку также были включены следующие родственные культуры: эталонный штамм – Paenibacillus larvae (NBIMCC 8478), культуры, выделенные из клинических образцов, 4 штамма близких видов бактерий. ДНК из бактериальных колоний выделяли стандартным методом, включающим нагревание и центрифугирование с использованием коммерческого набора (prepGem). Выделение ДНК из гнилостной массы сот проводилось в соответствии со стандартной и модифицированной процедурами. Для проведения мультиплексной ПЦР были использованы три пары праймеров, специфичных к 16S рРНК, и одна пара праймеров, специфичная для гена металлопротеазы (35 кДа) P. larvae в различных комбинациях. Чувствительность разработанного метода мультиплексной ПЦР для гнилостной массы составила 100%, что значительно превышало показатель чувствительности стандартного протокола (45.2%). Разработанный метод мультиплексной ПЦР может быть успешно использован для быстрого обнаружения Paenibacillus larvae как в гнилосной массе, так и в колониях выделенных бактерий.

ИГНАТОВ И., МОСИН О.В., СКЛАДНЕВ Д.А., ШВЕЦ В.И. — 2013 г.

Осуществлен микробиологический синтез 2H-меченого пуринового рибонуклеозида инозина (выход 3.9 г/л культуральной жидкости, КЖ) с использованием адаптированного к дейтерию штамма грамположительных хемогетеротрофных бактерий Bacillus subtilis в тяжеловодородной среде высокого уровня дейтерированности (99.8 атом. % 2) с 2%-ным гидролизатом дейтерированной биомассы факультативной метилотрофной бактерии Brevibacterium methylicum как источника 2-меченых ростовых субстратов, полученной в минимальной среде М9 с 98%-ной 2Н2 и 2%-ным [2H]метанолом. Фракционирование инозина из КЖ штамма-продуцента производили адсорбцией(десорбцией) на поверхности активированного угля, экстракцией 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80%-ном этаноле и колоночной ИОХ на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенном 0.3 М NH4-формиатным буфером с 0.045 М NH4Cl. Уровень дейтерированности инозина, исследованный методом масс-спектрометрии с бомбардировкой быстрыми атомами (ББА), составил 5 атомов дейтерия (62.5% 2) с включением 3 атомов дейтерия в рибозный и 2 атомов дейтерия в гипоксантиновый фрагменты молекулы.

ДОРОШЕНКО В.Г., ЛОБАНОВ А.О., ФЕДОРИНА Е.А. — 2013 г.

В результате последовательных направленных модификаций хромосомы из лабораторного штамма Escherichia coli MG1655+ с известной первичной структурой получен штамм MG1655+hisGr hisL?- purR, способный продуцировать гистидин из глюкозы с весовым коэффициентом конверсии 12. Устойчивая к ретроингибированию АТФ-фосфорибозил-трансфераза, кодируемая мутантным аллелем hisGr (E271K), явилась определяющим фактором для продукции гистидина. Дальнейшее увеличение продукции было достигнуто в результате увеличения уровня экспрессии мутантного his оперона, содержащего hisGr, посредством удаления аттенюатора (hisL?- ). Аналогичное увеличение экспрессии his оперона дикого типа к накоплению гистидина не приводило. Удаление гена транскрипционного регулятора purR увеличило накопление биомассы в условиях проведения ферментации, сохранив специфическую продукцию гистидина (на клетку).

КАТАШКИНА Ж.И., КИВЕРО А.Д., КУВАЕВА Т.М., СМИРНОВ С.В. — 2013 г.

Гены предполагаемых L-аспартат дегидрогеназ (КФ 1.4.1.21, АДГ) из мезофильных азотфиксирующих бактерий Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum были клонированы и экспрессированы в Escherichia coli. Соответствующие ферменты, в виде гибридных белков с N-концевой гексагистидиной меткой, были очищены до гомогенного состояния. Оба фермента in vitro катализировали восстановительное аминирование оксалоацетата до L-аспартата на порядок быстрее, чем обратную реакцию при соответствующих оптимальных pH 8.0–9.0 и 9.8; при этом ферменты катализировали только аминирование при физиологических условиях (рН 7.0–8.0). Их специфичность к НАДФН была на 1–2 порядка больше, чем к НАДН. Значения кажущихся констант КМ по оксалоацетату, аммонию и НАДФН при рН 9.0 для АДГ из R. palustris составили 9.2, 11.3 и 0.21 мМ соответственно, а для АДГ из B. japonicum – 21, 4.3 и 0.032 мМ. Аминирующая активность новых АДГ может быть важна для фиксации неорганического азота in vivo и использована для создания бактериального штамма-продуцента L-аспартата методами метаболической инженерии.

БАРАНОВА Н.А., ЕГОРОВ Н.С., КРЕЙЕР В.Г., КУРАКОВ А.В., ОСМОЛОВСКИЙ А.А. — 2013 г.

Проведена оптимизация условий глубинного и твердофазного культивирования микромицета Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D – продуцента внеклеточных протеиназ – активаторов протеина С плазмы крови человека. Показано, что в условиях твердофазного культивирования активаторная к протеину С активность микромицета в 1.5–3.5 раза выше по сравнению с глубинным культивированием из расчета на 1 мл питательной среды. Среди внеклеточных белков, секретируемых A. ochraceus ВКМ F-4104D при глубинном и твердофазном культивировании обнаружена активирующая протеин С протеиназа с pI 6.0–6.3.

БЕЛОВА С.П., МИРОНОВА Г.Д., МУРЗАЕВА С.В. — 2013 г.

Проведено тестирование адаптогенов – антигипоксантов, участвующих в активировании митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (митоКАТФ), на окисление флуорогенного индикатора Amplex Red (AR) в пероксидазной системе. Показано, что экстралайф, гипоксен, таурин и синтетический антиоксидант ионол по активности ингибирования флуоресценции располагаются в ряд: экстралайф > гипоксен > ионол > таурин и их действие зависит от концентрации. Расчетные показатели Ki флуоресценции показывают быструю и медленную фазы ингибирования окисления AR экстралайфом и гипоксеном. Быстрая фаза происходит в присутствии микродоз адаптогенов (0.05–3 мкг/мл) и связана с конкуренцией за Н2О2, что согласуется с нашими предыдущими данными об активировании митоКАТФ такими дозами адаптогенов, связанными с расходом Н2О2. Медленная фаза характерна высоким концентрациям адаптогенов и ионола и связана с конкуренцией за феноксил радикалы резоруфина, образуемые при окислении AR. Полученные результаты дают основание использовать высокочувствительную модельную пероксидазную систему с AR для предварительной оценки веществ, обладающих свойствами активаторов митоКАТФ канала.

ИВАНОВ А.В., ЛИСИЦКАЯ К.В., МАЛЫШЕВА Ю.Г., СОКУЕВА Н.А., СЯТКИН С.П., ШИШКИН С.С. — 2013 г.

На основе быстро пролиферирующих культивируемых клеток человека (линии LNCaP и РС-3) разработана новая биотест-система, с помощью которой охарактеризованы два известных синтетических полиамина – -дифторметилорнитин (ДФМО) и метилглиоксальбис(гуанилгидразон) (МГБГ), а также 4 новых синтетических аналога – дифенил-содержащие амины (ДФСА-1–ДФСА-4) с молекулярными массами (Да): ДФСА-1 – 725.5; ДФСА-2 – 755.5; ДФСА-3 – 655.5; ДФСА-4 – 681.5. В этой биотест-системе ДФМО (0.1–400 мкМ) не проявил функциональной активности, тогда как у МГБГ был зарегистрирован цитостатический эффект (100–200 мкМ). ДФСА-1, -2 и -4 оказывали подобный эффект при концентрациях 10 мкМ и выше, а ДФСА-3 – при концентрации 50 мкМ и выше. При этом ДФСА-1 с наибольшим антипролиферативным действием представляется особенно перспективным цитостатическим агентом.

БУРКИН А.А., КОНОНЕНКО Г.П. — 2013 г.

С помощью иммуноферментного анализа дана характеристика встречаемости и частоты накопления микотоксинов в лишайниках, принадлежащих к 20 родам семейств Cladoniaceae, Nephromataceae, Parmeliaceae, Peltigeraceae, Telosсhistaceae и Umbilicariaceae. Во всех родах, кроме Peltigera, могут регулярно обнаруживаться альтернариол, стеригматоцистин, микофеноловая кислота, цитринин, циклопиазоновая кислота и эмодин с содержанием более 1000 нг/г, т.е. 0.0001%. Обсуждается необходимость контроля безопасности препаратов на основе экстрактивных веществ лишайников.

ЗАКИРОВА С.А., МИХАЙЛОВА Т.В., ЭЛЬДАРОВ М.А. — 2013 г.

Исследованы физико-химические и энзиматические характеристики гибридных аналогов Gl7ACA-ацилазы бактерии Brevundimonas diminuta (BrdGLA), содержащих N-концевой хитинсвязывающий домен бактериальной хитиназы (BrdGlA/NmChBD), либо С-концевую олигогистидиновую последовательность (BrdGlA/H). Повышенная термостабильность BrdGlA/NmChBD может указывать на стабилизирующее влияние хитинсвязывающего домена. Исследование профилей зависимости энзиматической активности рекомбинантных аналогов BrdGlA от pH не выявило значительных различий: каталитическая активность обоих вариантов мало менялась в интервале рН 6.0–9.0 и резко снижалась при более низких значениях рН. Оба аналога обладали и сходным характером чувствительности к действию денатурирующих агентов, подвергаясь полной инактивации в присутствии 2.0 М гуанидин-хлорида. Разработана система получения изолированных рекомбинатных - и -субъединиц BrdGLA. В опытах in vitro по реконструкции фермента показано, что присутствие -cубъединицы необходимо для формирования правильной пространственной структуры -cубъединицы и образования функционально-активного фермента.

АМБАРЦУМЯН А.А., ЧАХАЛЯН А.Х., ЧИЛ-АКОПЯН Л.А. — 2013 г.

У ряда пигментообразующих культур Bacillus thuringiensis (BT) обнаружена прямая корреляция между розовой пигментацией колоний и образованием инсектицидных кристаллов – токсинов. Указанная закономерность впервые установлена нами у штаммов BT серотипов H3, H10, H16. Беспигментные клоны этих серотипов кристаллов не образуют. У штаммов серотипа H14, образующих овальные включения, эта закономерность не отмечена. Выявленная корреляция позволяет дифференцировать кристаллообразующие колонии в культурах указанных сероваров по наличию пигментации. Предлагаемый способ может служить эффективным экспресс-методом выявления вирулентных клонов, что особенно важно при использовании этих штаммов для производства инсектицидных препаратов.

СОЛОНИН А.С., ШАДРИН А.М., ШАПЫРИНА Е.В. — 2013 г.

Сконструированы рекомбинантные штаммы E. coli, экспрессирующие гены resD и resE Bacillus cereus ATCC 14579T, слитые с геном убиквитина, проведена очистка белков ResD и ResE, кодируемых этими генами. Использованный подход позволил впервые получить электрофоретически гомогенные препараты этих белков, минуя стадии очистки в денатурирующих условиях. Простота разработанного метода позволила использовать его для выделения и последующего скрининга мутантных вариантов ResD и ResE c высокой производительностью. Выход рекомбинантных белков составил 150 мг/г сырой массы клеток.

2013

БОГДАН В.И., ГАЛАНИНА Л.А., ИВАШЕЧКИН А.А., ЛУНИН В.В., МЫСЯКИНА И.С., СЕРГЕЕВА Я.Э., ФЕОФИЛОВА Е.П. — 2013 г.

Рассмотрены основные этапы биотехнологии получения биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов порядка Mucorales. Проведен скрининг грибов семейства Cunninghamellaceae, получены данные о липогенной активности изученных штаммов, и найден продуцент, образующий до 50% липидов, представленных в основном триацилглицеринами. Изучено влияние замены источника углерода и азота на более дешевые компоненты (в том числе отходы от ряда производств), их влияние на количество и основные характеристики конечного продукта. Использована экологически чистая методика извлечения липидов из мицелия грибов с помощью сверхкритических технологий. Обнаружена зависимость между содержанием липидов в посевном споровом материале и максимальным содержанием липидов в биомассе, что предлагается использовать для оптимизации биотехнологии и увеличения выхода конечного продукта.