научный журнал по биологии Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии ISSN: 0233-4755

ДАВЫДОВА В.Н., ЕРМАК И.М. — 2008 г.

Липополисахариды (ЛПС) – уникальные компоненты клеточных стенок грамотрицательных бактерий – представляют собой амфифильные биополимеры, сочетающие в пределах одной молекулы гидрофильные (О-специфические цепи, олигосахарид кора) и гидрофобный (липид А) фрагменты. ЛПС играют важную роль во взаимодействии микро- и макроорганизмов, они обладают широким спектром физиологических активностей, среди которых наиболее значимыми являются токсичность и способность активировать клетки иммунной системы. В основе многих биологических свойств ЛПС лежит способность взаимодействовать с высокой специфичностью с белками млекопитающих, такими как липопротеины, белки, увеличивающие бактерицидную проницаемость, и лизоцим. В результате этого взаимодействия происходит нейтрализация токсических свойств эндотоксина. ЛПС также служит мишенью для антибактериальных веществ поликатионной природы, используемых в терапии бактериальных инфекций. Изучение тонких молекулярных механизмов токсического эффекта ЛПС стимулировало появление новых подходов к его нейтрализации. Один из них заключается в использовании веществ, снижающих токсическое действие ЛПС на макроорганизм в результате образования с ним макромолекулярных комплексов. Это достаточно специфический прием, так как он не нарушает механизмы защиты хозяина от патогена. В связи с этим в последние годы активно исследуется взаимодействие ЛПС с несколькими классами катионных амфифильных молекул, включая белки, пептиды, синтетические полипептиды и полиамины, важной мишенью которых, благодаря отрицательному заряду, локализованному во внутренней части кора и в липиде А – токсическом центре ЛПС, является ЛПС. В обзоре рассмотрены механизмы взаимодействия ЛПС с растворимыми белками и поликатионами и модификация физиологической активности ЛПС в результате такого взаимодействия.

ОСТРОВСКИЙ М.А., СОКОЛОВ А.В., СОКОЛОВ В.С., ФЕЛЬДМАН Т.Б. — 2008 г.

Изучено взаимодействие ретиналя с плоскими бислойными липидными мембранами (БЛМ). Введение ретиналя в растворы с двух сторон мембраны, сформированной из дифитаноилфосфатидилхолина (DPhPC) либо его смеси с фосфатидилэтаноламином (DPhPC/DPhPE в весовом соотношении 3:5), приводило к изменению проводимости, индуцированной ионфорами – нонактином (увеличение проводимости) или пентахлорфенолом (уменьшение). Увеличение проводимости, индуцированной нонактином, зависело от липидного состава мембраны и было в 2 раза выше в случае смеси DPhPC/DPhPE. Изменение проводимости при использовании ионофоров разного знака было различным по направлению, что указывает на влияние ретиналя на дипольный потенциал при его проникновении в БЛМ. Разность граничных потенциалов, измеренная методом компенсации внутримембранного поля (КВП) после накопления ретиналя в мембране, не превышала 2.5 мВ, что может быть обусловлено его симметричным распределением в бислое. При освещении ретиналь вызывал уменьшение времени жизни мембран, сформированных из ненасыщенных липидов, и инактивацию встроенных в БЛМ грамицидиновых каналов, которая полностью ингибировалась тушителем синглетного кислорода (азид натрия). Сделан вывод о том, что аккумулированный в БЛМ ретиналь оказывает фотодеструктивное воздействие как на мембранные белки, так и на липидную компоненту мембран, окисляя ненасыщенные липиды, причем этот процесс в значительной степени обусловлен синглетным кислородом.

ВЫСОКИХ М.Ю., КАРГИН В.И., МОТОВИЛОВ К.А., ЯГУЖИНСКИЙ Л.С. — 2008 г.

Изучено влияние MitoQ10 – аналога коэнзима Q, содержащего положительно заряженную децилтетрафенилфосфониевую группировку (MitoQ10), на функции фосфорилирующих митохондрий печени. Методом ингибиторного анализа показано, что при добавлении в микромолярной концентрации этот хинон может восстанавливаться NADH-зависимой ДТ-диафоразой. При этом в условиях окисления малата хинон индуцирует перенос электронов от NADH на кислород, шунтируя блок электронного транспорта, который возникает в комплексе I при добавлении ротенона. Возникающее в присутствии ротенона и MitoQ10 (1 мкМ) стационарное дыхание митохондрий так же, как КЗ-шунт, блокируется дикумаролом – ингибитором ДТ-диафоразы, миксотиазолом – ингибитором комплекса III и цианидом – ингибитором цитохромоксидазы. Таким образом, в присутствии ротенона MitoQ10 индуцирует в митохондриях следующую цепь электронного транспорта: NADH ДТ-диафораза MitoQ10 комплекс III комплекс IV O2. Показано также, что в условиях окисления малата (но не сукцината) MitoQ10, как и высокие концентрации витамина К3, может индуцировать цианид-резистентное дыхание и открывание неспецифической поры в митохондриях и тем самым блокировать процесс окислительного фосфорилирования. На основании полученных данных сделан вывод, что MitoQ10 правильнее рассматривать не как аналог природного CoQ10, а как аналог гидрофильных хинонов (витамина К3, дурохинона и др.), хорошо известных как субстраты митохондриальной ДТ-диафоразы, с которой CoQ10 не взаимодействует.

КУЛАГИНА Т.П. — 2008 г.

Известно, что ядрам клеток млекопитающих присущ активный липидный метаболизм, причем внутриядерные системы с участием липидных мессенджеров могут функционировать независимо от мембранных и цитозольных сигнальных механизмов. Представление об этой автономности сформулировано на основании обнаружения синтеза полифосфоинозитидов и фосфатидилхолина, а также ферментов их синтеза в ядрах клеток млекопитающих. Использование 2-14-ацетата, включающегося в фосфолипиды в составе жирнокислотных цепей, предоставляет дополнительные возможности для выяснения путей синтеза внутриядерных липидов. В данной работе проведено сравнительное исследование включения радиоактивного предшественника в липиды цитозоля и изолированных ядер при их раздельной и совместной инкубации. Показано, что максимальное включение 2-14-ацетата в липиды наблюдается при инкубации одного цитозоля. Изолированные ядра также способны включать радиоактивный ацетат в липиды. Однако радиоактивность липидов изолированных ядер значительно ниже, чем липидов цитозоля. При совместной инкубации изолированных ядер и цитозоля наблюдается ингибирование включения вновь синтезированных жирных кислот в фосфолипиды ядер. Вследствие этого в ядрах происходит накопление радиоактивных свободных жирных кислот. В цитозоле вновь синтезированные радиоактивные жирные кислоты активно включаются в фосфолипиды, не накапливаясь в свободном виде. Количество свободных жирных кислот при инкубации ядер с цитозолем снижается в обеих фракциях, тогда как количество фосфолипидов и холестерина остается неизменным. Обсуждаются возможные механизмы появления радиоактивных липидов в изолированных ядрах клеток тимуса крыс.

КАБАШНИКОВА Л.Ф., САВЧЕНКО Г.Е. — 2008 г.

Изучали влияние кинетина на состояние мембран этиопластов в этиолированных проростках ячменя (Hordeum vulgare L.), контролируемое по изменению соотношения интенсивности флуоресценции двух форм протохлорофиллида (Пд) в низкотемпературных спектрах флуоресценции листьев, – длинноволновой (пигмент-белковые агрегаты) с максимумом свечения при 657 нм (Пд657) и коротковолновой (мономерной) с максимумом при 633 нм (Пд633). Действие кинетина (20 мкг/мл, опрыскивание) приводило к снижению величины отношения интенсивностией Пд657/Пд633, а тепловой шок (ТШ, 3 ч при 40°С) на фоне кинетина усиливал наблюдаемый эффект. Характер влияния кинетина на состояние форм Пд не зависел от возраста проростков (5, 6 или 7-дневные), но в более старых растениях эффект усиливался: отношение интенсивности флуоресценции двух спектральных форм Пд после ТШ снижалось в 5- и 7-дневных проростках соответственно в 1.4 и 1.3 раза, под влиянием кинетина – в 2.2 и 2.9, а при совместном действии кинетина и ТШ – в 3.0 и 4.4 раза по сравнению с контрольными вариантами. Обсуждаются возможные механизмы влияния кинетина на мембранную систему этиопластов.

ГАВРИЛОВА М.В., ДЬЯКОВ И.Н., СИДОРОВА Е.В., ЧЕРНЫШОВА И.Н. — 2008 г.

В отличие от спленоцитов клетки перитонеальной полости мышей не секретируют иммуноглобулины (ИГ). Уже через сутки после внутрибрюшинного введения спленоцитов, содержащих ИГ-образующие клетки (ИГОК), число ИГОК в брюшной полости мышей резко снижается. Это снижение не связано с “уходом” введенных клеток в селезенку, так как спленэктомия на этот процесс не влияет. Для проверки предположения о том, что отсутствие ИГОК в брюшной полости обусловлено угнетением синтеза/секреции ИГ, мышам внутрибрюшинно вводили перитонеальные клетки, которые предварительно инкубировали in vitro (содержали 4360 ИГОК/106 клеток). Через сутки в перитонеальной полости мышей-реципиентов выявлялось около 30% от числа перенесенных ИГОК, однако на 4-е сутки выявить ИГОК уже не удавалось. Повторная инкубация клеток брюшной полости реципиентов in vitro приводила к появлению ИГОК. Полученные данные свидетельствуют о том, что перитонеальное микроокружение угнетает функциональную активность В-лимфоцитов.

ВИШНЯКОВА Х.С., ЕГОРОВ Е.Е., ПАНЮХИН Н.В. — 2008 г.

Изучали влияние парциального давления кислорода в атмосфере, окружающей культуральную среду, на выживание, пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костного мозга мыши. Показано, что в присутствии 3% кислорода увеличивается выживаемость клеток при редкой посадке, возрастает скорость их роста и продолжительность пролиферации. Влияние концентрации кислорода на пролиферацию значительно сказывается уже через несколько дней культивирования. Изучение колониеобразования МСК при различном уровне кислорода показало, что даже преинкубация в условиях 21% кислорода отрицательно сказывается на дальнейшем росте клеток при 3% кислорода, а выращивание клеток при 3% кислорода благотворно для их пролиферации в присутствии 21% кислорода. При этом нельзя однозначно говорить о вредном воздействии атмосферного кислорода. Оказалось, что сниженное парциальное давление кислорода тормозит остеогеннную дифференцировку МСК, но не выявлено достоверного влияния содержания кислорода на адипогенную дифференцировку. Таким образом, уровень кислорода в среде способен влиять не только на их пролиферацию, но и на эффективность дифференцировки клеток.

ИВАНОВ А.Ю., КАБАНОВ Д.С., МЕЛЦЕР М., ПРОХОРЕНКО И.Р. — 2008 г.

Роль поверхностных белков и заряда мембраны эритроцитов человека во взаимодействии с липополисахаридом (ЛПС) из Escherichia coli О55:В5 (ЛПСE.coli ) исследована двумя независимыми методами: проточной цитофлуориметрией и клеточным электрофорезом. Модификация стереохимических свойств поверхности клеток трипсином вызывала увеличение интенсивности флуоресценции эритроцитов после их инкубации с ЛПСE.coli, меченным флуорофором, на 16%, а также снижение относительных значений электрофоретической подвижности (ЭФП) клеток до 16%. Удаление сиаловых кислот с поверхности эритроцитов нейраминидазой не оказывало значительного влияния как на относительные значения ЭФП эритроцитов, так и на интенсивность флуоресценции после инкубации клеток с ЛПС. Таким образом, установлено, что определяющую роль при встраивании S-структуры ЛПС в мембраны эритроцитов человека играют стереохимические факторы, тогда как роль заряда поверхности клетки не столь значима.

ПОЛАДЯН А., ТАДЕВОСЯН Л., ТРЧУНЯН А., ТРЧУНЯН К. — 2008 г.

Показано, что модификация тиоловых (SH-) групп мембранных белков с помощью 5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислоты), или реагента Эллмана, уменьшает потоки протонов из клетки в среду и ионов калия в клетку, нарушает К+-зависимую и N,N-дициклогексилкарбодиимид-чувствительную АТP-азную активность и выработку молекулярного водорода (H2) анаэробно выращенными бактериями Escherichia coli дикого типа (рН 7.5). Однако этот реагент не влияет на указанные процессы, если остаток цистеина в b-субъединице F0 протонной F0F1--азы заменить на аланин. Более того, в присутствии реагента Эллмана снижается резкое падение окислительно-восстановительного потенциала среды (ОВП), обусловленное выделением H2, как при сбраживании глюкозы, так и при утилизации формиата. Подобные изменения отмечены при действии SH-реагента – сукцинимидил-6( -малеинидопропионамидо)-гексоната. Другой тиоловый реагент – N-этилмалеимид, подобного действия не оказывает, но потоки ионов и АТР-азная активность при этом подавляются. Полученные данные подтверждают важную роль тиоловых групп и остатка цистеина в b-субъединице F0 протонной F0F1--азы в протонно-калиевом обмене и образовании H2 клетками E. coli [см. Мнацаканян Н. и др. // Биол. мембраны. 2002. Т. 19. С. 183–192]. Более того, они указывают на возможное участие SH-групп в TrkA-системе поглощения К+ и гидрогеназ 4 или 3 во взаимодействии этих мембранных белков друг с другом.

БУРЛАКОВА Е.Б., ГЕНЕРОЗОВА И.П., ЖИГАЧЕВА И.В., КОНОВАЛОВ А.И., ФАТКУЛЛИНА Л.Д., ФАТТАХОВ С.Г., ШУГАЕВ А.Г. — 2008 г.

Cопоставлены эффекты низких доз регулятора роста растений мелафена на мембраны растительного и животного происхождения. Изучено влияние различных концентраций препарата (от 2 ? 10-7 до 4?10-12 М) на структурные характеристики мембран, прежде всего на микровязкость свободного липидного бислоя и аннулярных, связанных с белковыми кластерами, липидов мембран. Показано, что действующие концентрации мелафена для мембран растительного и животного происхождения различаются и носят дискретный характер: эффективной является либо концентрация 2 ? 10-7 М, либо 4?10-12 М в зависимости от типа и липидного компонента мембран. Параллельно изучали влияние мелафена на уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах в условиях внешних стрессовых воздействий. Показано, что препарат в концентрациях, оказывающих влияние на микровязкость свободных и аннулярных липидов мембран растительного и животного происхождения, снижает и интенсивность процессов ПОЛ. Предполагается, что влияние малых и сверхмалых концентраций препарата на структурное и функциональное состояние биологических мембран обусловлено его взаимодействием с сигнальными рецепторами в клеточных мембранах и органеллах растительного и животного происхождения.

МЕТЛИНА А.Л., НОВИКОВА Т.М., СПЕРАНСКИЙ В.В. — 2008 г.

Методом электронной микроскопии проведено изучение структуры обнаруженной нами ранее в аппарате подвижности Halobacterium salinarum внутриклеточной дискообразной пластинчатой структуры (ДПС), а также детали включения в нее проксимальных концов жгутиков. Анализ результатов, в том числе полученных после фиксации срезов с помощью перманганата калия, позволяет предположить, что ДПС, отсутствующая у бактерий, включает мембраноподобное образование. Электронно-микроскопические фотографии “теней” клеток, полученных мягким разрушением их при снижении концентрации NaCl, позволили изучить детали как структуры самой ДПС, так и способа базирования на них проксимальных концов жгутиков. Обсуждается организация аппаратов подвижности бактерий и архей как двух представителей отдельных доменов.

ВАЛИАХМЕТОВ А.Я. — 2008 г.

Обзор посвящен систематизации и анализу данных о влиянии геометрии мембраны на различные процессы, протекающие в живых клетках. Кривизна мембраны в некоторых случаях является решающим фактором, регулирующим активность ферментов, а также в белок-липидных взаимодействиях. Это продемонстрировано на примере регуляции активности ряда важных ферментов: фосфолипазы А2, протеинкиназы С, фосфатидилсериндекарбоксилазы 2, цитохрома Р450, фосфатидилинозит-3-киназы, СТР:фосфохолин-цитидилтрансферазы, дигликозилдиацилглицеринсинтазы, G-белка ArfGAP1, гидролизующего GTP в составе Arf-GTP. Кроме того, рассмотрено влияние геометрии мембраны и напряжения изгиба бислоя (curvature stress) на проникновение в клетку цитотоксичных и троянских пептидов, на процесс образования пор при проникновении вирусов в клетку, фолдинг мембранных белков и освобождение цитохрома с из митохондрий при апоптозе. Делается заключение о том, что геометрия мембраны и сопряженная с ней энергия напряжения изгиба являются критическими параметрами во многих жизненно важных клеточных процессах, в том числе в регуляции некоторых ключевых ферментов.

БАШКИРОВ П.В., ЕВСЕЕВ А.И. — 2008 г.

Завершающим этапом эндоцитоза является деление тонкого мембранного перешейка, или нанотрубки (НТ), связывающего плазматическую мембрану с образующейся везикулой. Этот процесс изучался нами на модельной системе, представляющей собой мембранную НТ, вытянутую из плоской бислойной липидной мембраны. Деление мембранной НТ производилось с помощью приложения осмотического давления. Оно создавалось подведением к НТ пипетки с концентрированным раствором соли. Использование дистиллированной воды вместо концентрированного раствора соли приводило к расширению НТ, из чего можно сделать вывод об обратимости процессов расширения–сжатия НТ под действием осмотического давления. Показано, что общая картина деления сходна с таковой, наблюдавшейся ранее при делении НТ с участием GTP-азы динамина. А именно, в обоих случаях для деления НТ ее необходимо сжать до критического радиуса. Полученная величина критического радиуса превышает значение, полученное при белковом делении. Деление под действием осмотического давления, так же как деление с участием динамина, не сопровождалось появлением проводящих дефектов.

ЗАЙЦЕВ С.Ю., ЛЕВАЧЕВ С.М., ФАДЕЕВ А.С., ЯМПОЛЬСКАЯ Г.П. — 2008 г.

Изучены монослои фибриллярного белка коллагена на границе раздела фаз вода–воздух в присутствии мочевины и тиомочевины в субфазе. Основной особенностью монослоев коллагена на границе раздела вода–воздух является способность к образованию надмолекулярных структур (фибрилл), которые в свою очередь также образуют монослой со своей точкой коллапса. Из-за этого в -A изотермах монослоя коллагена существуют два “квазилинейных” участка, разделенные плато, т.е. жидко-растянутое и жидко-конденсированное состояния, что отличает монослои коллагена от других белков. Показано, что в монослое коллаген проходит через те же стадии структурной организации, что и в объеме. Свойства монослоев коллагена быстро и необратимо изменяются в присутствии денатурирующих добавок по сравнению с монослоем на чистой воде. Тиомочевина оказывает на монослои коллагена значительно более сильное денатурирующее действие, чем мочевина. Эти изменения возрастают с увеличением концентрации денатуранта и времени выдерживания монослоя. Нами предложен механизм, описывающий денатурирующее действие тиомочевины на фибриллярные белки, заключающийся в гидрофобном взаимодействии группы C=S тиомочевины с неполярными участками на поверхности белка и последующей переориентации карбонильных групп белка на образование водородных связей с NH -группами тиомочевины и разрывом собственных водородных связей.

АЛИВЕРДИЕВА Д.А., БОНДАРЕНКО Д.И., МАМАЕВ Д.В. — 2008 г.

Исследовали транспорт сукцината и цитрата в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, измеряя скорость их окисления клетками и используя не проникающие через плазмалемму эффективные конкурентные ингибиторы этого окисления – O-пальмитоил-L-малат и 2-ундецилмалонат. Линейность ингибирования в координатах Диксона свидетельствовала о том, что 2-ундецилмалонат подавлял лимитирующую стадию в окислении обоих субстратов. Поскольку ингибитор непроникающий, скорость окисления исследованных субстратов лимитируется скоростью их транспорта через плазмалемму. Использованный методический подход позволял за 30–40 мин измерить кинетические параметры транспортера в одной пробе, контролируя в той же пробе сохранение лимитирующих условий. Vmax окисления сукцината зависела от рН, монотонно возрастая от почти нулевых значений при рН 4.5 до максимальных при рН 7.5. При рН 5.5 транспорт обоих субстратов был нечувствителен к действию протонофора FCCP, активировался в присутствии ионов Na+, конкурентно ингибировался ионами К+ и характеризовался близкими величинами констант конкурентного ингибирования 2-ундецилмалонатом. Это позволило предположить, что оба субстрата поступают в дрожжевую клетку через общий переносчик плазмалеммы, что не характерно для транспортеров плазмалеммы грибов. При рН 6.5 катионы триса, K+, Na+ не влияли на скорость окисления сукцината. Величина Kм для сукцината уменьшалась при увеличении рН мононатриевой среды параллельно с ростом доли дианионной формы субстрата. Обсуждаются необычная субстратная специфичность и механизм транспорта дикарбоксилатов через плазмалемму клетки S. cerevisiae.

БОЛЬШЕВА Н.Л., ГРОМЫКО А.В., ЕГОРОВА Е.И., ЖУЗЕ А.Л., ЗЕЛЕНИН А.В., ИВАНОВ А.А., МУРАВЕНКО О.В., ПОПОВ К.В., ЮРКЕВИЧ О.Ю. — 2008 г.

Изучена возможность применения 10 новых флуоресцентных красителей для дифференциального окрашивания хромосом. Большая часть исследованных соединений представляет собой димерные производные красителя Hoechst 33258. Соединения различаются как размерами линкера, соединяющего бисбензимидазольные мотивы, так и модификациями самих мотивов. Специфичность флуорохромов в отношении хроматина проверяли путем окрашивания фиксированных препаратов фибро-бластов человека. Отобраны четыре соединения (DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18)), придававшие яркую флуоресценцию хроматину при возбуждении в ультрафиолетовой области спектра ( = 365 нм) и не вызывавшие флуоресценции ядер или цитоплазмы при возбуждении синим или зеленым светом. Эти свойства красителей необходимы для окрашивания хромосом после проведения процедуры многоцветной флуоресцентной гибридизации in situ. Красители DB(8) и DB(18) проявили меньшую скорость обесцвечивания в сравнении с более яркими, но менее стабильными красителями DB(7), DB(17), Hoechst 33258 и DAPI. Способность придавать хромосомам дифференциальную исчерченность (бэндинг) определяли на метафазных хромосомах человека. При обработке каждым из четырех отобранных соединений обнаружен флуоресцентный бэндинг, аналогичный выявляемому DAPI (Q-бэндинг). Рисунок после окраски соединениями DB(8) и DB(17) был более контрастным, чем после окраски DAPI. При окрашивании хромосомных препаратов льна (Linum grandiflorum L.) соединениями DB(7), DB(8), DB(17), DB(18) выявлялся рисунок, подобный таковому при С- и DAPI-дифференциальному окрашиванию. Не выявлено различий в характере окрашивания хромосом льна тестируемыми соединениями. Результаты проведенного анализа в сочетании с данными о высокой ДНК-специфичности бис-лигандов дают основания предполагать перспективность использования новых АТ-специфичных флурохромов DВ (8) и DВ (17) в исследовании хромосом человека и растений.

АЛИЕВА И.Б., БИРЮКОВА А.А., ВЕРИН А.Д., СМУРОВА К.М. — 2008 г.

Эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность сосудов, выполняет барьерную функцию – регулирует проницаемость сосудистой стенки, обеспечивая обмен между циркулирующей в сосудах кровью и тканевой жидкостью. Нарушение нормальной функции (дисфункция) эндотелия связано с последовательной перестройкой цитоскелета клеток, активацией актомиозинового сокращения и, как следствие, образованием промежутков между эндотелиальными клетками. Микротрубочки являются первым эффекторным звеном в цепи реакций, приводящих к барьерной дисфункции. Дисфункция эндотелия приводит к повышению проницаемости сосудистой стенки, наблюдаемой при многих заболеваниях человека, а также является побочным эффектом лечения онкологических заболеваний препаратами, блокирующими митоз. В работе предполагалось выяснить, можно ли предотвратить побочные эффекты митостатических агентов, связанные с дисфункцией эндотелия, подобрав концентрацию митостатического агента, воздействующую на микротрубочки, но не вызывающую барьерной дисфункции эндотелия. Популяция микротрубочек в клетках эндотелия неоднородна: наряду с динамичными микротрубочками в цитоплазме присутствуют и модифицированные посттрансляционно микротрубочки – менее динамичные и более стабильные в отношении внешних воздействиий. Оказалось, что в клетках эндотелия область, занимаемая стабильными микротрубочками, весьма значительна (около трети от всей клетки), что, как мы предположили, повышает устойчивость системы микротрубочек эндотелиального монослоя к воздействиям, приводящим к барьерной дисфункции. В настоящей работе данное предположение проверяли, используя в качестве индуктора дисфункции эндотелия нокодазол. Эффект нокодазола на цитоскелет эндотелиальных клеток является дозозависимым – использование нокодазола в микромолярных концентрациях приводит к необратимым нарушениям не только барьерной функции, но и жизнедеятельности клеток, вплоть до их гибели. В наномолярных концентрациях нокодазол также вызывает увеличение проницаемости эндотелиального монослоя, однако в интервале 100–200 нМ этот процесс обратим. Нокодазол в концентрации 100 нМ вызывает частичное разрушение микротрубочек на краю клетки, но не оказывает существенного влияния на количество ацетилированных микротрубочек и актиновых филаментов. Повышение концентрации до 200 нМ приводит к значительному разрушению системы динамичных, но не ацетилированных микротрубочек, а также к увеличению содержания актиновых филаментов в центральном районе клетки. Таким образом, разрушение периферических микротрубочек запускает каскад реакций, приводящих к барьерной дисфункции эндотелия, но наличие значительного количества стабильных микротрубочек, устойчивых к наномолярным концентрациям нокодазола, позволяет клетке не только сохранить жизнеспособность, но и восстановить функциональную активность.

ВЫШЕНСКАЯ Т.В., КРЕТУШЕВ А.В., ТЫЧИНСКИЙ В.П., ЯГУЖИНСКИЙ Л.С. — 2008 г.

Методом динамической фазовой микроскопии измеряли рефрактерность мембран одиночных митохондрий. Исследование основано на данных наших предыдущих работ, в которых обнаружено, что приложение электрического поля к искусственным, а также к митохондриальным мембранам вызывает резкое увеличение их рефрактерности. В условиях работы протонных насосов значение рефрактерности отдельной митохондрии в 2–4 раза превышает среднее значение рефрактерности деэнергизованных митохондрий. В настоящем исследовании установлено, что величина мембранного потенциала в энергизованных митохондриях может изменяться в соответствии с внешними условиями; в этих процессах участвует митохондриальная система осморегуляции. Показано, что величина рефрактерности (разность показателей преломления одиночной митохондрии и среды) в случае деэнергизованных митохондрий равна 0.02 ± 0.01. Это значение в несколько раз ниже значения рефрактерности энергизованных митохондрий, на мембранах которых есть электрический потенциал. Ранее на модельной мультислойной системе, сформированной из очищенного природного лецитина, показана линейная зависимость рефрактерности этой системы от величины приложенного электрического поля. Существование этой корреляции подтверждает связь между величиной рефрактерности одиночной митохондрии и величиной потенциала на мембране митохондрии, возникающего при работе протонных комплексов. При нормальных условиях (тоничность среды инкубации 250 мОсм) митохондрия ведет себя как динамическая система, которая осциллирует в минутной шкале между двумя состояниями с разными значениями рефрактерности (согласно вышесказанному, с разной величиной мембранного потенциала). Время перехода между этими состояниями 10–30 с, время жизни каждого состояния – несколько минут. Построение гистограмм, характеризующих распределение значений рефрактерности отдельных энергизованных митохондрий в популяциях, состоящих из 20–30 органелл, позволило идентифицировать два отдельных пика (фракции II и III) со средними значениями рефрактерностей 0.05 ± 0.01 и 0.09 ± 0.01 соответственно. Эти фракции соответствуют двум долгоживущим состояниям митохондрий. В гипотонических условиях (120 мОсм) идентифицировано только одно “статическое” состояние митохондрий, при котором отсутствуют осцилляции, и рефрактерность митохондрий в популяции не превышает 0.05 ± 0.01 (фракция II). Измерения на митопластах доказали, что наблюдаемые на митохондриях значения рефрактерности связаны с внутренней митохондриальной мембраной. Сделан вывод о существовании двух дискретных состояний митохондрий. При регистрации быстрых низкоамплитудных флуктуаций рефрактерности отдельных митохондрий в спектрах обнаружены частотные компоненты в интервале 1–3 Гц. Высказано предположение, что появление этих частот определяется неравномерностью процесса функционирования протонных насосов митохондрий: при функционировании АТР-азного насоса наблюдаются частотные компоненты в диапазоне 1.8–2.4 Гц, а при функционировании дыхательных протонных насосов преобладают частоты 1–1.3 Гц.

КНЯЗЕВ Д.Г., РАДЮХИН В.А., СОКОЛОВ В.С. — 2008 г.

Связывание матриксного белка М1 с бислойной липидной мембраной (БЛМ) регистрировалось по изменению граничного потенциала методом компенсации внутримембранного поля. Адсорбция белка на мембране после его введения в водный раствор приводила к медленному увеличению граничного потенциала до достижения стационарного значения за время, зависящее от количества добавленного белка. Стационарное значение потенциала возрастало при понижении рН раствора, концентрации KCl, а также при введении в состав БЛМ отрицательно заряженных липидов. Показано, что возрастание потенциала при понижении рН вызвано увеличением заряда молекул М1, а не их поверхностной концентрации и не изменением заряда липидов. На основании того, что потенциал не уменьшался при удалении белка из раствора, сделан вывод о необратимости связывания М1 на поверхности мембраны. Полученные результаты объясняются тем, что на адсорбцию белка влияют как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия молекул М1 между собой и с липидной мембраной. Предложен механизм диссоциации белкового каркаса, образуемого М1 в вирионе, при понижении рН, согласно которому каркас дестабилизируется из-за электростатического отталкивания молекул белка, вызванного увеличением их положительного заряда.

АТАУЛЛАХАНОВ Ф.И., БУТЫЛИН А.А., ВОРОБЬЕВ А.И., КУЗНЕЦОВА С.А., ОВЧИНИНА Н.Г., ШИШКИН А.В., ШМЫРЕВ И.И. — 2008 г.

Описаны иммунологические биочипы для определения поверхностных антигенов эритроцитов, относящихся к системам АВ0 и Rh (D, E, e, C, c). Биочипы представляют собой прозрачные пластиковые подложки, на которые нанесены пятна (диаметром 1.5 мм) иммобилизированных антител IgM, специфичных к соответствующим антигенам. Для проведения анализа с помощью этих биочипов достаточно 1–2 мкл крови. Показано избирательное связывание эритроцитов с иммобилизированными на биочипе антителами, и продемонстрирована возможность морфологического исследования связавшихся клеток. С помощью проточной камеры исследована зависимость отрыва связанных с антителами эритроцитов от сдвиговой скорости потока при отмывке биочипа. Показано, что в сочетании с проточной камерой биочип может быть использован для концентрирования клеток, имеющих те или иные антигены, из смешанной суспензии, даже если их содержание в смеси невелико.